Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim
Summary
Burada, ortak ilgi bir viroid iskele ve bir bitki RNA içeren bir chimeric RNA ifade ederek Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol mevcut tRNA ligaz. Ana ürün arıtma homojenliği için kolaylaştırır dairesel bir moleküldür.
Abstract
Giderek artan bir ilgi RNA biyoloji ve sofistike biyoteknolojik uygulamaları RNA molekülleri kullanımı, rekombinant RNA’ların büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sınırlıdır. Burada, biz bir viroid iskele ve bir bitki ilgi RNA içeren chimeric molekülünün ortak ifade dayalı Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol tarif tRNA ligaz. Viroids daha yüksek bitkilerin bulaşıcı nispeten küçük, kodlamayan, son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA’lar vardır. Ana bitki tRNA ligaz olan RNA daireselleşmesi viroid çoğaltma sırasında aracılık Avsunviroidae, patlıcan gizli viroid (ELVd), gibi ailesine ait viroids tarafından işe bir enzim. Her ne kadar ELVd E. coliçoğaltmak değil, bir ELVd öncül verimli E. coli RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ve bakteri hücreleri içinde katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenen ve elde edilen monomerleri tarafından circularized ortak ifade tRNA ligaz dikkate değer bir konsantrasyon ulaşan. Bir RNA ilgi ELVd iskele içine ekleme normal laboratuvar koşullarında bakteriyel kültürünün litre başına rekombinant RNA miligram onlarca üretimini sağlar. RNA ürün ana bir kısmını yuvarlaktır sanal homojenliği için rekombinant RNA arıtma kolaylaştırır bir özellik. Bu protokol için tamamlayıcı DNA (cDNA) faiz RNA için karşılık gelen bir ELVd cDNA belirli bir pozisyon, patlıcan tRNA ligaz, ortak ifade etmek için plazmid E. colidönüştürmek için kullanılan bir ifade plazmid olarak eklenir. Güçlü kurucu Rehberleri kontrol altında her iki moleküllerin ortak ifade rekombinant RNA büyük miktarda üretim için açar. Rekombinant RNA bakteriyel hücrelerinden çıkarılan ve onun Döngüsellik yararlanarak bakteriyel RNA’ların toplu ayrılmış.
Introduction
DNA ve proteinler aksine kolay, verimli ve düşük maliyetli üretim RNA büyük miktarda protokollerde bol değildir. Ancak, biyoteknolojik uygulamaları, çok özel aptamers olarak bunların kullanımı da dahil olmak üzere araştırma ve Sanayi talep onların benzersiz biyolojik özellikleri1araştırmak veya istihdam için bu biomolecules miktarda artan sofistike 2, terapötik ajanlar3veya selektif pestisit4. İn vitro transkripsiyon ve kimyasal sentez yaygın olarak araştırmada RNA üretmek için kullanılır. Ancak, büyük miktarda ürün gerekli olduğunda bu yöntemler önemli sınırlamalar gerektirecektir. Mantıksal alternatif hücresel arkadaşları faiz RNA’lar ayırmak için bir arıtma işlemi ardından yaşam hücrelerinin endojen transkripsiyon makine kullanmaktır. Bu stratejiyi yöntemleri geliştirilmiştir laboratuvar dostu gibi bakteri hücreleri içinde rekombinant RNA’ların üretmek için Escherichia coli5 veya deniz mor Kemotrofik Alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. bir tRNA ya da RNA ilgi olduğu bir rRNA7eklenen gibi bakterilerde rekombinant RNA üretmek için pek çok yöntem bir yerel son derece kararlı RNA iskele ifade üzerinde güveniyor. İlave RNA varlığı8karşıdan akış uygulamaları için bir sorun ise bu çıkar chimeric molekül RNA bırakmadan gerekliliği getirir. Başka bir kavram olarak rekombinant RNA biyoteknoloji istenen ürün başına olabilir veya faiz9RNA kararlılığını artırmak için koruyucu bir strateji olarak kullanılan rekombinan Ribonükleoprotein kompleksleri yapımıdır, 10. Benzer şekilde, dairesel RNA’ların üretimi daha istikrarlı ürünleri11oluşturmak için bir strateji olarak sürülmüştür.
Biz son zamanlarda üç yukarıdaki kavramlar katılan E. coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için yeni bir yöntem geliştirdik: son derece kararlı bir dairesel RNA iskele ilgi RNA ve ortak bir ifade ekleme bakteriyel dikkate değer miktarlarda biriken büyük olasılıkla istikrarlı Ribonükleoprotein karmaşık üretmek için rekombinant RNA etkileşen bir protein ile12hücreleri. Aksine önceki gelişmeler, E. coliiçin yani bir viroid tamamen yabancı bir RNA iskele kullandık. Viroids sadece nispeten küçük tarafından (246-401 nt) oluşturulan daha yüksek bitkilerin bulaşıcı ajanlar çok özel bir türü vardır son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA13. İlginçtir, viroids RNA’ların kodlamayan ve kendi proteinler hiçbir yardımıyla, onlar virüslü ana14karmaşık bulaşıcı döngüleri tamamlamak mümkündür. Bu döngüleri çekirdeği veya kloroplast, viroid aile bağlı olarak RNA, RNA-RNA çoğaltma dahil —Pospiviroidae veya Avsunviroidae, sırasıyla — hareket virüslü bitki ve konak savunma yanıtının kaçakçılığı. Viroids doğada, çıplak bir dairesel RNA olmak ve enfekte bitki hücreleri düşmanca bir ortamda hayatta kalmak sahip bir sonucu olarak en istikrarlı RNA’ların arasında yer gerekir. Bu özellik viroids iskele rekombinant RNA biyoteknolojik yaklaşımlar stabilize etmek için özellikle uygun hale getirebilir. Buna ek olarak, yeni yöntemi ile etkileşen bir bitki protein viroid iskele iş ifade temel alır. Viroids hangi ana enzimler işleminin farklı adımları katalizler işe bir haddeleme-daire mekanizması ile çoğaltma. Özellikle bazı viroids, özellikle bu aile Avsunviroidae15‘ e, ait Ayrıca çoğaltmaya katılan çokluğunun içerir. Viroid tür bağlı olarak, viroid RNA transkripsiyonu RNA polimeraz II ana bilgisayar veya chloroplastic kodlanmış nükleer RNA polimeraz (NEP) tarafından aracılık ettiği. Viroid RNA işleme görünmek-e doğru ev sahibi tarafından katalize tip III RNase, her ne kadar viroids ile çokluğunun oligomeric RNA içinde ara ürün çoğaltma sırasında kendi kendine ayırmak. Son olarak, elde edilen viroid monomerleri, viroid aile bağlı olarak, ana bilgisayar DNA ligaz 1 veya chloroplastic izoformu tRNA ligaz16,17circularized. Bu son enzim ligasyonu patlıcan gizli viroid (ELVd)18gibi aile Avsunviroidae, viroids monomeric formları ilgilenmektedir.
Patlıcan (Solanum melongena L.) tarafından tanıma belirleyen sıralı ve yapısal gereksinimlerini ELVd analiz etmek için bir çalışma sırasında tRNA ligaz, biz ortak ifade E. coli hem moleküllerin dayalı deneysel bir sistem kurmak 19. biz birim daha uzun ELVd transkript verimli katıştırılmış hammerhead çokluğunun ile E. coli hücrelerde kendi kendine ayırmak olduğunu ve elde edilen viroid monomerleri ile 5′-hidroksil ve 2′ 3′-fosfodiester termini olduğunu fark verimli bir şekilde birlikte ifade patlıcan tRNA ligaz tarafından circularized. Daha da, elde edilen dairesel viroid RNA E. coli, beklenmeyen bir yüksek konsantrasyon endojen rRNA’lar12olanların aşan ulaştı. Çoğaltma intermediates yokluğu ELVd RNA, RNA-RNA amplifikasyon bu bakteri hücreleri içinde eksikliği gösterilir. İlginçtir, viroid molekülünün belirli bir konumda Contegra RNA’ları ekleme döngüsel viroid kaynaklı RNA’ların12birikimi ılımlı bir etkisi vardı. Bu gözlem bize rekombinant RNA’ların bakterilerde büyük miktarlarda üretmek için bir yöntem öngörülüyor yaptı. Bu yöntemde, faiz RNA’lar için karşılık gelen cDNAs ELVd cDNA eklenir ve elde edilen chimeric RNA güçlü bir bünye organizatörü E. coli ifade edilir. Sistemin çalışması için E. coli patlıcan tRNA ligaz ifade etmek için bir plazmid ile birlikte dönüştürülmesi gerekir. ELVd elde edilen birim daha uzun transkript katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenir ve uygun termini ile elde edilen monomerleri tanınır ve ortak ifade tRNA ligaz tarafından circularized. Bu şekilde ilgi RNA çok kararlı bir dairesel iskele viroid dairesel molekülünün oluşan eklenir. Bu rekombinant chimeric RNA en büyük ihtimal daha fazla bir Ribonükleoprotein tRNA ligaz ile etkileşimi aracılığıyla karmaşık oluşumu tarafından E. coli hücrelerin içinde stabilize. Bu yöntemi kullanarak (bkz: protokolü aşağıdaki), RNA aptamers, saç tokası RNA’ların ve diğer yapısal RNA’ların edilmiş kolayca litre başına miligram E. coli kültür düzenli laboratuvar koşullarında onlarca miktarda üretilen ve alarak homojenliği için saf Döngüsellik12avantajı.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELVd sırası ve yapısı gereksinimleri tanıma patlıcan tRNA ligaz ile ilgili araştırma yaparken, biz liderliğindeki viroid dairesel büyük beklenmedik bir birikimi olmayan ana bilgisayar E. coli hem moleküllerin Co bu ifadeyi fark formları bakteri hücreleri19. Biz viroid RNA E. coli olarak büyük birikimi en büyük olasılıkla son derece kararlı bir RNA molekülü, nispeten küçük gibi ortak ifade sonucu olduğunu anladım (333 nt), son derece dayalı eşleştiri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe BIO2017-83184-R ve BIO2017-91865-EXP gelen İspanyol “gayri resmi” de Ciencia, Innovación y Universidades (ortak sermayeli FEDER fonlar) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
- Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
- Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
- Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
- Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
- Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
- Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
- Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
- El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
- Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
- Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
- Daròs, J. -. A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
- Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).
- Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
- Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
- Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
- Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
- Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
- Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
- Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
- Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
- López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).
