ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהבעת משותפת של RNA chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. המוצר העיקרי הוא מולקולה מעגלית המקל על טיהור עד הומוגניות.
Abstract
עם הגדלת ההתעניינות RNA ביולוגיה והשימוש של מולקולות RNA ביישומים הביו-טכנולוגיה מתוחכמת, השיטות להפקת כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי מוגבלים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהתבסס על ביטוי משותף של מולקולה chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. Viroids הם RNAs עגול קטן יחסית, ללא קידוד, מאוד בסיס לזווג שאינן זיהומיות צמחים גבוהים יותר. המארח לשתול tRNA ליגאז הוא אנזים גויס על ידי viroids שייך למשפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd), לתווך RNA circularization במהלך וירואיד שכפול. למרות ELVd לא לשכפל ב e. coliקודמן ELVd ביעילות עיבד על ידי e. coli RNA פולימראז, עיבדה את ribozymes האמרהאד מוטבעים תאים חיידקיים, שנוצר מונומרים הם circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף להגיע ריכוז יוצא דופן. החדרת RNA עניין לתוך לגרדום ELVd מאפשר הייצור של עשרות מיליגרם רקומביננטי RNA לליטר של התרבות חיידקי בתנאי מעבדה רגיל. שבר העיקרי של המוצר RNA היא מעגלית, תכונה המאפשרת הטיהור של הרנ א רקומביננטי כדי הומוגניות וירטואלי. ב פרוטוקול זה, תואמת DNA (cDNA) משלימים ל RNA עניין נוסף במצב מסוים של cDNA ELVd ב פלסמיד ביטוי המשמש, לאורך פלסמיד לבטא משותפת ליגאז tRNA חציל, להפוך את החיידק. ביטוי משותף של שתי מולקולות תחת השליטה של היזמים מכוננת חזק מוביל לייצור כמויות גדולות של הרנ א רקומביננטי. הרנ א רקומביננטי יכול להיות שחולצו מן התאים חיידקי, הופרדו עיקר RNAs חיידקים ניצול של מעגליות שלה.
Introduction
בניגוד DNA, חלבונים, פרוטוקולים לייצור קל, יעיל וחסכוני של כמויות גדולות של RNA אינם בשפע. עם זאת, המחקר והתעשייה דרישה להגדיל כמויות של מולקולות אלה כדי לחקור תכונות ביולוגיות ייחודיות שלהם1, או להיות מועסק ב מתוחכמים ביוטכנולוגי יישומים, כולל שימוש ספציפי מאוד aptamers 2, סוכני טיפולית3או הדברה סלקטיבי4. תמלול במבחנה, סינתזה משמשים במחקר לייצר RNA. עם זאת, שיטות אלה כרוכה מגבלות חשובות כאשר כמויות גדולות של המוצרים נדרשים. החלופה ההגיונית היא להשתמש את מכונות שעתוק אנדוגני של תאים חיים, ואחריו תהליך טיהור להפריד את RNAs עניין חבריו הסלולר. בעקבות אסטרטגיה זו, פותחו שיטות כדי לייצר RNAs רקומביננטי בתאי חיידקים, כגון המעבדה-הידידותית Escherichia coli5 או את ימית סגול phototrophic האלפא-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. לרוב השיטות לייצור RNA רקומביננטי בחיידקים להסתמך על הביטוי של לפיגום RNA יליד יציב מאוד, כגון להוסיף tRNA או של rRNA, בהן הרנ א עניין הוא7. זה מטיל את ההכרח משחרר את הרנ א עניין מחוץ מולקולת chimeric, אם הנוכחות של RNA נוספת היא בעיה עבור יישומי הזרם8. המושג ב רקומביננטי ביוטכנולוגיה RNA הוא הייצור של מכלולים ribonucleoprotein רקומביננטי ייתכן המוצר הרצוי כשלעצמו או השתמשו כאסטרטגיה מגן כדי להגביר את היציבות RNA של ריבית9, 10. באופן דומה, הייצור של RNAs מעגלית גם הוצע כאסטרטגיה לייצר מוצרים יציב יותר11.
לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה להפקת כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב e. coli המשתתפת בשלוש מתוך המושגים לעיל: החדרת את הרנ א ביקוש לפיגום RNA מעגלי יציב מאוד וביטוי שיתוף רקומביננטי RNA עם חלבונים אינטראקציה לייצר סביר של ribonucleoprotein יציב מורכבים שמצטבר בכמויות מדהים בבקטריאלי תאים12. בניגוד התפתחויות הקודם, השתמשנו זר לחלוטין כדי e. coli, כלומר וירואיד של RNA לגרדום. Viroids הם סוג מאוד מסוים של מדבקים של צמחים גבוהים יותר באופן בלעדי היוו מאת קטן יחסית (246-401 nt) מאוד בסיס לזווג מעגלית רנ א13. מעניין, viroids הם ללא קידוד RNAs, בלי עזרה של חלבונים משלהם, הם מסוגלים להשלים את מורכבות מחזורים זיהומיות ב לנשאים נגועים14. מחזורים אלה כוללות שכפול רנ א-ל-RNA גרעינים או מהכלורופלסט, בהתאם משפחת וירואיד —Pospiviroidae או Avsunviroidae, בהתאמה – תנועה דרך צמחים נגועים התחמקות של התגובה ההגנתית המארח. Viroids חייב להיות מדורגת בין RNAs היציב ביותר בטבע, כתוצאה להיות ה-RNA מעגלי עירומים ויש להם לשרוד בסביבה עוינת של תאי צמחים נגועים. מאפיין זה עלול להפוך viroids מתאים במיוחד כמו פיגומים לייצב רקומביננטי RNA בגישות הביו-טכנולוגיה. בנוסף, השיטה החדשה מבוססת על שיתוף לביטוי לגרדום וירואיד עם חלבון אינטראקציה הצמח. Viroids שכפל באמצעות מנגנון מתגלגל-מעגל בפונדקאי אשר מגויסים אנזימים כדי לעודד את השלבים השונים של התהליך. בייחוד את viroids קצת, ליתר דיוק אלה השייכים המשפחה Avsunviroidae15, מכילים ribozymes המעורבים גם שכפול. תלוי בזן וירואיד, שעתוק של וירואיד RNAs מתווך על-ידי המחשב המארח RNA פולימראז II או את chloroplastic הגרעיני מקודד ה-RNA פולימראז (NEP). וירואיד RNA עיבוד נראה להיות מזורז על-ידי מחשב מארח RNase סוג-III, למרות ב viroids עם ribozymes oligomeric RNA intermediates עצמית קליב במהלך שכפול. בסופו של דבר, שנוצר מונומרים וירואיד הם circularized, בהתאם משפחת וירואיד, את מארח ה-DNA ליגאז 1 או איזופורם chloroplastic tRNA ליגאז16,17. אנזים זה האחרון מעורב מצדו של צורות monomeric של viroids משפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd)18.
במהלך עבודה כדי לנתח את הדרישות רצף מבניים של ELVd הקובעים הכרה על ידי החציל (סולנום melongena ל’) ליגאז tRNA, הקמנו מערכת ניסיוני המבוסס על ביטוי משותף של שתי מולקולות ב e. coli 19. הבחנו כי עוד יותר-יחידות ELVd תעתיקים עצמית קליב ביעילות בתאים e. coli עד ribozymes האמרהאד מוטבע וכי וירואיד שנוצר מונומרים עם 5′-הידרוקסיל, 2′, טרמיני 3′-phosphodiester circularized ביעילות על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף חציל. אפילו יותר, RNA מעגלי וירואיד וכתוצאה מכך להגיע של ריכוז גבוה לא צפוי ב e. coli, מעבר. rRNAs אנדוגני12. היעדר שכפול intermediates הצביעו על חוסר ELVd רנ א-ל-RNA הגברה תאים חיידקיים אלה. מעניין, החדרת heterologous RNAs במצב מסוים של המולקולה וירואיד הייתה השפעה מתונה על הצטברות של מעגלי נגזר וירואיד RNAs12. תצפיות אלה גרמו לנו לדמיין שיטה לייצר כמויות גדולות של רקומביננטי RNAs בחיידקים. בשיטה זו, cDNAs התואמים RNAs עניין הנוספים של cDNA ELVd, הרנ א chimeric וכתוצאה מכך זה מתבטא ב e. coli דרך מקדם מכוננת חזקה. עבור מערכת לעבודה, e. coli ולשוד במשותף עם פלסמיד לבטא את ליגאז tRNA חציל. בתמליל עוד יותר-יחידות הנגזרות ELVd יעובד על-ידי ribozymes האמרהאד מוטבע, שנוצר מונומרים עם טרמיני המתאים מזוהה, circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף. בדרך זו, הרנ א עניין מוכנס לתוך לפיגום מעגלית יציב מאוד המורכב של המולקולה המעגלית וירואיד. רנ א רקומביננטי זה chimeric היא ככל הנראה עוד התייצב בתוך התאים e. coli על ידי היווצרות ribonucleoprotein מורכבים תוך אינטראקציה עם ליגאז tRNA. בשיטה זו (ראה פרוטוקול להלן), RNA aptamers, סיכת ראש RNAs RNAs מובנים אחרים יש כבר בקלות מיוצר בכמויות של עשרות מיליגרם לליטר של e. coli תרבות בתנאי מעבדה רגיל וטיהרו את ההומוגניות לוקח היתרון של מעגליות12.
Protocol
Representative Results
Discussion
כשחיפשתי את רצף ELVd ודרישות מבנה מעורב ההכרה על ידי ליגאז tRNA חציל, שמנו לב את הביטוי שיתוף של שתי מולקולות ב-פונדקאי e. coli הוביל הצטברות גדולה לא צפויה של וירואיד מעגלית טפסים תאים חיידקיים19. הבנו כי הצטברות גדולה של וירואיד RNA ב e. coli ככל הנראה היה התוצאה של שיתוף לבטא מו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים BIO2017-83184-R ו- BIO2017-91865-EXP מ ספרדי Ministerio דה Ciencia, Innovación y Universidades (שותפה במימון קרנות פדר).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
- Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
- Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
- Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
- Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
- Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
- Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
- Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
- El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
- Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
- Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
- Daròs, J. -. A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
- Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).
- Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
- Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
- Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
- Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
- Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
- Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
- Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
- Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
- López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).
