En In Vivo -metode til at studere mus blod-Testis barriere integritet
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere blod-testis barriere integritet ved at indsprøjte inulin-FITC i testiklerne. Dette er en effektiv i vivo metode til at studere blod-testis barriere integritet, der kan være kompromitteret af genetiske og miljømæssige elementer.
Abstract
Spermatogenesen er udvikling af spermatogonia til modne sædceller i testiklerne seminiferous tubules. Denne proces understøttes af Sertoli celler vejkryds på blod-testis barriere (BTB), som er den strammeste væv barriere i selve pattedyr og udskiller seminiferous epitel i to rum, en basal og en adluminal. I BTB skaber en unik mikromiljø for kønsceller i meiose jeg / II og til udvikling af postmeiotiske spermatider til sædceller via spermiogenesis. Her, beskriver vi en pålidelig analyse til at overvåge BTB integritet af musen testiklerne i vivo. En intakt BTB blokerer diffusion af FITC-konjugeret inulin fra de basale til den apikale rum af de seminiferous tubules. Denne teknik egner sig til at studere gen kandidater, vira eller miljømæssige giftstoffer, der kan påvirke BTB funktion eller integritet, med en let procedure og en minimal krav på kirurgiske færdigheder i forhold til alternative metoder.
Introduction
Pattedyr spermatogenesen betragtes som en meget struktureret proces, som omfatter spermatogonial selvfornyelse og differentiering gennem spermatocytes i haploide sædceller via mitose og meiose spermiogenesis, hvorunder dramatiske biokemiske og morfologiske ændringer sker. Udvikle kønsceller transporteres gradvis fra bunden af den seminiferous tubulus mod lumen. Denne proces er reguleret af celle-celle kontakter mellem kimceller og Sertoli celler1,2. Tilstødende Sertoli celler danner den BTB, der ligger i nærheden af bunden af de seminiferous tubuli. I BTB opdeler fysisk epitel i en basal og et adluminal rum. Gennemførelsesstadier VIII – IX af epitel cyklus, overføre preleptotene/leptotene spermatocytes fra de basale rum på tværs af BTB, ind i adluminal rum3. Derfor, BTB funktion er at give en immunoprivileged mikromiljø for færdiggørelsen af meiose og spermiogenesis4,5,6. I modsætning til andre blod-væv barrierer (f.eks, blod – hjerne barrieren), der kun består af stram vejkryds (TJs), er BTB dannet af fire forskellige vejkryds (TJs ektoplasmiske specialer, gap vejkryds og mellemliggende glødetråd-baseret desmosomes) mellem Sertoli celler1,7.
Mange undersøgelser har brugt genmodificerede mus, virusinfektioner og miljømæssige giftstoffer til at undersøge mekanismerne for BTB integritet7,8,9. BTB forstyrrelser inducerer nedsat spermatogenese og subfertilitet eller infertilitet. Da BTB dannelse og integritet er blevet bekræftet at være påvirket af kontakter mellem Sertoli celler8, en in vitro- model baseret på primær kultur af isolerede Sertoli celler har været anvendt til BTB undersøgelse. Denne model kan ikke nøjagtigt efterligne BTB dynamics in vivo. Derudover er ingen sådan fælles kultur af kønsceller med Sertoli celler blevet oprettet som at afspejle alle relevante strukturelle og funktionelle komponenter af BTB10,11.
I almindelighed, er i vivo BTB integritet assays typisk baseret på små molekyler, såsom EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin og FITC-konjugeret inulinsirup (inulin-FITC). Normalt, er diffusion af biotin eller inulin-FITC fra de basale rum blokeret af BTB struktur. Derfor, vi er i stand til at bruge denne metode til at vurdere omfanget af BTB skade sammenlignet med kontrolgruppen. Mens BTB kan blive kompromitteret med visse typer af stimuli, såsom behandling med cadmium chlorid (CdCl2)12, bliver BTB tilgængelige for små molekyler, som i sidste ende kommer ind i adluminal rum som indikatorer.
En tidlig i vivo BTB integritet analyse indebærer injektion af biotin eller inulin-FITC i halsfedt, som indebærer kirurgi, og er invasiv, kompliceret og tidskrævende. Desuden som reporter stoffer diffuse gennem hele kroppen via omsætning, er den lokale koncentration af biotin eller inulin-FITC i seminiferous tubules begrænset. Derudover kan systemisk eksponering fremkalde immun reaktioner. Her præsenterer vi en enkel og effektiv i vivo BTB integritet assay muliggør direkte injektion af en lille alikvot af inulin-FITC i interstitium af en testis. Brug af fluorescerende mærkning metode, er farvning processen praktisk, som sekundære antistoffer ikke er påkrævet. Her er processen med fluorescerende farvestof indtastning testiklerne visualiseret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spermatogenesen foregår i seminiferous epitel og er en yderst bestilte og dynamisk proces, der styres af kønsceller og somatiske celler (f.eks. Sertoli celler)13. BTB-struktur, der er fremstillet af Sertolicellerne, opdeler seminiferous epitel i en basal og en apikale rum. Udviklingen af meiotiske og haploide kønsceller opstår i den apikale rum, som danner en immunologisk barriere14.
Funktionen BTB kan blive kompromitteret a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den nationale nøgle R & D Program i Kina (2016YFA0500902), National Natural Science Foundation of China (31471228, 31771653), Jiangsu Science Foundation for fremtrædende unge akademikere (BK20150047), naturvidenskabelige Grundlæggelsen af Jiangsu provinsen (BK20140897, 14KJA180005) og den innovations- og iværksætterevner Program af Jiangsu-provinsen til K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
