Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi
Summary
Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.
Abstract
Sperma testis seminifer tübüllerin içinde olgun sperm hücreleri içine spermatogonia gelişmedir. Bu işlem Sertoli hücre kavşaklar, memeli vücuttaki dar doku engeldir ve iki bölmeleri, bir bazal ve bir adluminal seminifer epitel diğer kan-testis bariyeri (BTB), tarafından desteklenmektedir. BTB germ hücreleri için benzersiz bir microenvironment mayoz oluşturur ı / II ve sperm ile spermiogenesis içine postmeiotic spermatids gelişimi için. Burada, fare testis içinde vivobütünlüğünü BTB izlemek için güvenilir bir tahlil açıklayın. Sağlam bir BTB FITC Birleşik seminifer tübüllerin apikal bölmesinin inulin bazal üzerinden difüzyon engeller. Bu teknik gen adaylar, virüsler veya BTB işlevi veya kolay bir prosedür ve cerrahi becerileri alternatif yöntemlerine göre en az bir şartı ile bütünlüğü etkileyen çevresel toxicants çalışmak için uygundur.
Introduction
Memeli sperma spermatogonial kendini yenileme ve spermatocytes aracılığıyla hangi dramatik sırasında farklılaşma yolu ile spermiogenesis, mitoz ve mayoz haploit sperm hücreleri içine kapsayan son derece yapılandırılmış bir süreç olarak kabul edilir biyokimyasal ve morfolojik değişiklikler oluşur. Gelişmekte olan germ hücreleri aşamalı olarak lümen doğru Seminifer tübül tabanından taşınmaktadır. Bu işlem germ hücreleri ve Sertoli hücreleri1,2arasında hücre-hücre kişiler tarafından düzenlenmiştir. Bitişik Sertoli hücreleri Seminifer tübül Bankası bulunan BTB oluştururlar. BTB fiziksel olarak bir bazal ve bir adluminal bölme epitel ayırır. VIII – IX epitel döngüsünün aşamaları sırasında bazal bölmeleri gelen preleptotene/leptotene spermatocytes adluminal bölmeleri3girme BTB karşıdan karşıya geçirin. Bu nedenle, BTB fonksiyonu mayoz ve spermiogenesis4,5,6tamamlanması için bir immunoprivileged microenvironment sağlamaktır. Sadece sıkı kavşak (TJs) oluşan diğer kan doku engelleri farklı olarak (Örneğin, kan – beyin bariyerini), BTB tarafından dört farklı kavşak (TJs, ektoplazmik Uzmanlıklar, gap kavşaklar ve ara filaman tabanlı oluşturulur desmosomes)1,7arasında Sertoli hücreleri.
Birçok çalışma mekanizmaları BTB bütünlük7,8,9araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş fare, virüs enfeksiyonları ve çevre toxicants kullandık. BTB bozulma Engelli sperma ve subfertility ya da kısırlık neden olmaktadır. BTB oluşumu ve bütünlük kişiler arasında Sertoli hücreleri8etkilenmeye teyit edilmiştir beri izole Sertoli hücre birincil kültür temel bir vitro modeli kullanılan BTB çalışma için. Ancak, bu model doğru BTB dinamiği içinde vivotaklit edemez. Ayrıca, germ hücre Sertoli hücreleri ile eş böyle kültür yok yeteneğine sahip tüm ilgili yapısal ve işlevsel bileşenleri BTB10,11yansıtan olarak kurulmuştur.
Genel olarak, VIVO BTB bütünlük deneyleri genellikle küçük moleküllerin, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin ve FITC Birleşik inulin (inulin-FITC) dayanır. Normalde, biotin veya inulin-FITC bazal yuvası üzerinden difüzyon BTB yapısı tarafından engellenir. Bu nedenle, biz kontrol grubu ile karşılaştırıldığında BTB hasar ölçüde değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. BTB sonunda adluminal bölme göstergeleri olarak girin küçük moleküller için erişilebilir süre BTB uyaranlara, kadmiyum klorür (CdCl2)12, tedaviyle gibi belirli türleri ile tehlikeye girebilir.
Bir erken vivo içinde BTB bütünlük tahlil biotin veya inulin-FITC ameliyat içerir ve invaziv, karmaşık ve zaman alıcı juguler ven enjekte içerir. Ayrıca, muhabir maddeler kan dolaşımı yoluyla tüm vücuda diffüz olarak biotin veya inulin-FITC seminifer tübüllerin içinde yerel konsantrasyonu sınırlıdır. Ayrıca, sistemik pozlama bağışıklık tepkileri neden olabilir. Burada, inulin-FITC küçük bir aliquot bir testis interstitium içine direkt enjeksiyon etkinleştirme basit ve etkili içinde vivo BTB bütünlük tahlil mevcut. İkincil antikorlar gerekli değildir olarak etiketleme yöntemi floresan, boyama işlemi uygun, kullanmaktır. Burada, floresan boya testis girme sürecinin görüntülenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sperma seminifer epitel yer alır ve germ hücreleri ve somatik hücreler tarafından yönetilir son derece düzenli ve dinamik bir süreçtir (Örneğin, Sertoli hücreleri)13. Sertoli hücreleri tarafından oluşturulur, BTB yapısı bir bazal ve apikal bir bölme seminifer epitel ayırır. Segregasyonun ve haploit germ hücre gelişimi bir bağışıklık bariyer14oluşturan apikal kompartımanda oluşur.
BTB işlev tarafınd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ayırt edici genç bilim adamları için (BK20150047), Doğa Bilimleri ulusal anahtar R & D Çin programı (2016YFA0500902), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31471228, 31771653), Jiangsu Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Jiangsu Eyaleti (BK20140897, 14KJA180005) ve Jiangsu Eyaleti K.Z. için yenilikçi ve girişimci Program temeli
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
