Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per valutare l’integrità di barriera ematotesticolare iniettando inulina-FITC in testicoli. Si tratta di un metodo efficiente in vivo per studiare l’integrità della barriera ematotesticolare che può essere compromessa da elementi genetici e ambientali.
Abstract
Spermatogenesi sono lo sviluppo di spermatogoni in spermatozoi maturi nei tubuli seminiferi del testicolo. Questo processo è supportato da giunzioni delle cellule di Sertoli alla barriera ematotesticolare (BTB), che è la barriera più stretta di tessuto nel corpo dei mammiferi e segrega l’epitelio seminifero in due scomparti, una basale e un adluminal. La BTB crea un microambiente unico per le cellule germinali nella meiosi I / II e per lo sviluppo della postmeiotiche spermatidi in spermatozoi tramite spermiogenesi. Qui, descriviamo un test affidabile per monitorare l’integrità BTB del testicolo topo in vivo. Un intatto BTB blocca la diffusione di inulina FITC coniugato dal basale al compartimento apicale dei tubuli seminiferi. Questa tecnica è adatta per lo studio dei candidati gene, virus o tossici ambientali che possono influire sulla funzione BTB o integrità, con una procedura facile e un requisito minimo di abilità chirurgiche rispetto ai metodi alternativi.
Introduction
Spermatogenesi mammifera sono considerato un processo altamente strutturato che comprende degli spermatogoni auto-rinnovamento e differenziazione attraverso spermatociti in spermatozoi aploidi tramite mitosi e meiosi spermiogenesi, durante il quale drammatica si verificano cambiamenti biochimici e morfologici. Cellule germinali in via di sviluppo sono progressivamente trasportate dalla base del tubulo seminifero verso il lume. Questo processo è regolato da contatti cellula-cellula fra le cellule germinali e le cellule Sertoli1,2. Cellule di Sertoli adiacenti formano il BTB che si trova vicino alla base del tubulo seminifero. La BTB divide fisicamente l’epitelio in un basale e un vano di adluminal. Durante fasi VIII – IX del ciclo epiteliale, preleptotene/leptotene spermatociti dai comparti basali migrano attraverso il BTB, entrando il adluminal scomparti3. Di conseguenza, la funzione del BTB è di fornire un microambiente di nuova per il completamento della meiosi e spermiogenesi4,5,6. A differenza di altre barriere di sangue-tessuti (ad es., barriera emato – encefalica) che sono composti solo da giunzioni strette (TJs), il BTB è formata da quattro diverse giunzioni (TJs, specializzazioni ectoplasmatica, giunzioni di gap e basati su filamento intermedio desmosomi) tra Sertoli cells1,7.
Molti studi hanno utilizzato topi geneticamente modificati, infezioni da virus e tossici ambientali per studiare i meccanismi di BTB integrità7,8,9. La rottura di BTB induce la spermatogenesi alterata e infertilità o sterilità. Poiché la formazione di BTB e l’integrità sono stati confermati per essere influenzata dai contatti tra le cellule di Sertoli8, un modello in vitro basato su colture primarie di cellule di Sertoli isolate è stato usato per lo studio BTB. Tuttavia, questo modello non può simulare accuratamente BTB dynamics in vivo. Inoltre, nessun tale co-coltura delle cellule di germe con le cellule di Sertoli è stato stabilito come capace di riflettere tutti i relativi componenti strutturali e funzionali dei BTB10,11.
In generale, in vivo BTB integrità saggi sono in genere basati su piccole molecole, come EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e coniugato FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la diffusione della biotina o inulina-FITC dal vano basale è bloccata dalla struttura BTB. Pertanto, siamo in grado di utilizzare questo metodo per valutare l’entità del danno BTB rispetto ai gruppi di controllo. Mentre BTB può essere compromessa con determinati tipi di stimoli, quali il trattamento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB diventa accessibile a piccole molecole, che alla fine entrare nel compartimento di adluminal come indicatori.
Un’analisi iniziale di in vivo BTB integrità consiste nell’iniettare biotina o inulina-FITC nella vena giugulare, che comporta un intervento chirurgico ed è invasivo, complicato e richiede molto tempo. Inoltre, le sostanze di reporter diffondono attraverso tutto il corpo attraverso la circolazione, la concentrazione locale di biotina o inulina-FITC nei tubuli seminiferi è limitata. Inoltre, l’esposizione sistemica può indurre reazioni immuni. Qui, presentiamo un semplice ed efficace in vivo BTB integrità dosaggio consentendo ad iniezione diretta di una piccola aliquota di inulina-FITC nell’interstizio di un testicolo. Utilizzando il metodo di etichettatura fluorescente, il processo di colorazione è conveniente, come gli anticorpi secondari non sono necessari. Qui, il processo di tintura fluorescente entrando il testicolo è visualizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spermatogenesi avviene nell’epitelio seminifero ed è un processo altamente ordinato e dinamico che è disciplinato dalle cellule germinali e le cellule somatiche (per es., cellule di Sertoli)13. La struttura BTB, che è costruita dalle cellule di Sertoli, divide l’epitelio seminifero in un basale e un compartimento apicale. Lo sviluppo delle cellule germinali meiotiche e aploidi avviene nel compartimento apicale che forma una barriera immunologica14.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta dalla chiave nazionale di R & D programma della Cina (2016YFA0500902), National Foundation Natural Science of China (31471228, 31771653), la Fondazione di scienza di Jiangsu per illustri giovani studiosi (BK20150047), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e il programma Innovative e imprenditoriale della provincia di Jiangsu a K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
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