Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la integridad de barrera Hematotesticular inyectando inulina-FITC en los testículos. Este es un método eficiente en vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular que puede estar comprometida por elementos genéticos y ambientales.
Abstract
Espermatogénesis es el desarrollo de espermatogonias en espermatozoides maduros en los túbulos seminíferos de los testículos. Este proceso es apoyado por las ensambladuras de la célula de Sertoli en la barrera del sangre-testis (BTB), que es la barrera de tejido más apretada en el cuerpo mamífero y segrega el epitelio seminífero en dos compartimentos, una basal y adluminal un. La BTB crea un microambiente único de las células germinales en la meiosis I / II y para el desarrollo de postmeiotic espermátides en espermatozoides por medio de la espermiogénesis. Aquí, describimos un análisis confiable para monitorear la integridad BTB de testículo de ratón en vivo. Un BTB intacto bloquea la difusión de la inulina FITC conjugado desde la basal en el compartimento apical de los túbulos seminíferos. Esta técnica es adecuada para el estudio de candidatos de genes, virus o tóxicos ambientales que pueden afectar la función BTB o integridad, con un procedimiento fácil y un requisito mínimo de habilidades quirúrgicas en comparación con métodos alternativos.
Introduction
Espermatogénesis mamíferos se consideran un proceso altamente estructurado que comprende espermatogonias de auto renovación y diferenciación a espermatocitos en espermatozoides haploides por mitosis, meiosis y espermiogénesis, que dramático ocurren cambios bioquímicos y morfológicos. Células germinales en desarrollo progresivamente son transportadas desde la base de los túbulos seminíferos hacia el lumen. Este proceso está regulado por los contactos de la célula entre las células germinales y células de Sertoli1,2. Las células de Sertoli adyacentes forman la BTB se encuentra cerca de la base del túbulo seminífero. La BTB físicamente divide el epitelio en un básico y un compartimento adluminal. Durante las etapas VIII – IX del ciclo epitelial, espermatocitos preleptotene/leptoteno de los compartimentos basals migran a través de la BTB, entrar en los compartimientos adluminal del3. Por lo tanto, la función de la BTB es proporcionar un microambiente de immunoprivileged para la terminación de la meiosis y espermiogénesis4,5,6. A diferencia de otras sangre-tejido barreras (e.g., barrera blood – brain) que se componen sólo de uniones estrechas (TJs), el BTB está formado por cuatro diferentes cruces (TJs, especializaciones ectoplasmáticos, ensambladuras de gap y base de filamento intermedio desmosomas) entre el Sertoli de células1,7.
Muchos estudios han utilizado ratones modificados genéticamente, infecciones por virus y sustancias tóxicas ambientales para investigar mecanismos de BTB integridad7,8,9. La interrupción de la BTB induce la espermatogénesis deteriorada y subfertilidad o infertilidad. Puesto que la formación de la BTB y la integridad han sido confirmados para ser afectado por los contactos entre las células de Sertoli8, un modelo en vitro basado en cultivo primario de células de Sertoli aisladas se ha utilizado para el estudio BTB. Sin embargo, este modelo no puede imitar exactamente BTB dinámica en vivo. Por otra parte, esa cultura no Co de las células germinales con las células de Sertoli se ha establecido como capaz de reflejar todos los componentes estructurales y funcionales relevantes de la BTB10,11.
En general, en vivo ensayos de integridad BTB se basan normalmente en moléculas pequeñas, como EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina y conjugados con FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la difusión de la biotina o inulina-FITC desde el compartimiento basal es bloqueada por estructura BTB. Por lo tanto, somos capaces de utilizar este método para evaluar la magnitud del daño de la BTB en comparación con grupos control. Mientras que TBB puede verse comprometida con ciertos tipos de estímulos, tales como el tratamiento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB se convierte en accesible a moléculas pequeñas, que finalmente entran en el compartimento adluminal como indicadores.
Un temprano en vivo TBB integridad ensayo implica la inyección de biotina o inulina-FITC en la vena yugular, que consiste en una cirugía y es invasiva, complicado y desperdiciador de tiempo. Además, como las sustancias reportero difunden a través de todo el cuerpo vía la circulación, la concentración local de biotina o inulina-FITC en los túbulos seminíferos es limitada. Por otra parte, la exposición sistémica puede inducir reacciones inmunes. Aquí, presentamos un sencillo y eficaz en vivo TBB integridad ensayo que permite la inyección directa de una pequeña alícuota de inulina-FITC en el intersticio de un testículo. Usando el fluorescente etiquetado método, el proceso de tinción es conveniente, como anticuerpos secundarios no son necesarios. Aquí, se visualiza el proceso de colorante fluorescente en el testículo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Espermatogénesis tiene lugar en el epitelio seminífero y es un proceso altamente ordenado y dinámico que está regido por las células germinales y células somáticas (p. ej., las células de Sertoli)13. La estructura de la BTB, que está construida por células de Sertoli, divide el epitelio seminífero en un básico y un compartimiento apical. El desarrollo de las células germinales meióticas y haploides se produce en el compartimento apical que forma una barrera inmunol?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la nacional clave de R & D programa de China (2016YFA0500902), el nacional Ciencias naturales Fundación de China (31471228, 31771653), la Fundación de ciencia de Jiangsu para jóvenes distinguidos eruditos (BK20150047), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) y el programa de innovador y emprendedor de la provincia de Jiangsu a K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
