Summary
本文的目的是为 vx2 肝癌兔模型的开发和应用提供一个入门。
Abstract
兔 vx2 肿瘤是介入放射学领域肝细胞癌 (hcc) 转化研究的常用动物模型。该模型采用了一种再生鳞状细胞癌, 该细胞癌在供体家兔的骨骼肌中容易和可靠地传播, 以便最终收获并同种异体移植植入天真受者的肝脏。这种肿瘤移植在受者兔的肝脏中迅速生长成血管造影可识别的肿瘤, 其特征是由一个可行的血管高血管囊包围的坏死核。兔子解剖的物理大小足以促进血管器械, 允许各种介入技术的应用和测试。尽管有这些好处, 但缺乏技术资源, 无法作为研究人员使用该模型的具体参考。在此, 我们提出了一个全面的视觉概述的技术方面的发展, 生长, 繁殖, 和血管造影利用的兔子 vx2 肿瘤模型, 供新手和有经验的研究人员使用。
Introduction
兔 vx2 肿瘤模型自 1935年 1,2发展以来, 在实验肿瘤学中发挥了重要作用。该肿瘤是一种病毒引起的再生鳞状细胞癌, 其特征是血管增生、生长快、在骨骼肌中容易繁殖 3,4。而兔 vx2 肿瘤模型已被用来研究多种癌症5,6,7,8;本文的重点是肝癌9。
所述方法的目的是提出一个模型的原发性肝癌, 或肝细胞癌 (hcc), 可用于介入放射科医生的翻译研究。它可用于药代动力学研究、治疗调查和消融方法检测10,11,12,13,14,15.
与老鼠、老鼠、土木等老鼠模型或灵长类动物 1 6号等较大模型等其他模型相比, 本文详细介绍的方法具有多重优势.主要好处之一是肿瘤生长迅速可靠, 这使得研究人员能够在第一次后肢繁殖后一个月内建立活跃的肿瘤线.此外, 这种肿瘤有直接的超声表现可见性和高血管的外围, 这允许跨动脉局部治疗和消融治疗。最后, 也是最重要的, 兔子血管的大小允许可行和技术上容易利用血管器械 18.
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Protocol
以下协议遵循伊利诺伊大学芝加哥分校规定的所有要求和准则。它在执行前经过了当地动物护理和使用机构委员会的审查和批准。
1. vx2 hind 肢体肿瘤的发展
- 从国家癌症研究所癌症治疗诊断和治疗肿瘤细胞系存储库中获得 vx2 肿瘤细胞系。
注意: 此时, 订单目录可在以下链接中找到: https://dtp.cancer.gov/repositories/。 - 准备注射用细胞悬浮液, 将冷冻的 vx2 样品和甲基纤维素培养基放入温水中, 直到它们解冻。
- 将解冻的细胞悬浮液和同等数量的解冻甲基纤维素培养基吸血到5毫升注射器中。
注意: 它可能有助于使用21或 22 g 针吸气细胞悬浮液和一个更大的规格针吸气甲基纤维素培养基。将注射器放在冰上。
- 将解冻的细胞悬浮液和同等数量的解冻甲基纤维素培养基吸血到5毫升注射器中。
- 为细胞悬浮液的接种准备后肢肿瘤供体兔, 从肌内注射的 1 mg kg 环丙嗪和 0.02 mg/kg 丁丙诺非开始。剃光部位 (后肢) 用剪子和清洁剃光的是以酒精或碘为基础的药物。
注: 美洛昔康可在皮下0.2 mg* 千克的剂量下给予镇痛。兔子的皮毛很难刮胡子。建议研究人员进行多次传球, 首先重点清理大部分皮草, 然后将剪子按在皮肤上, 与谷物对着干。 - 将 16 g 针连接到含有细胞悬浮液的5-ml 注射器上, 并将1毫升的悬浮液注射到供体兔后肢肌肉的腹部, 深度约1厘米。一定要保护坐骨神经沿着股骨在一个明显的沟槽内运行。
注: 新鲜 vx2 成功接种88% 的对象, 而冷冻和解冻 vx2 只有33% 的时间19成功。
注意: vx2 肿瘤会迅速生长。随着肿瘤的进展, 可能会注意到副作用是: 呼吸速率增加, 嗜睡, 警觉性下降, 和/或行为变化 (例如, 异常的攻击性)。因此, 建议密切监测动物, 并计划在接种后两周内收获肿瘤。
2. vx2 hind 肢体肿瘤生长和收获
注: 假设接种成功, 在2周内, 注射部位应出现明显 (3\u20124 厘米) 肿瘤结节。通常情况下, 这个结节将在1周左右明显;然而, 最好是让肿瘤生长, 以便有足够的组织收集。通常情况下, 这个结节将是坚定的, 缩进, 并高于肌肉的水平。如果
- 在接种后2周将接种区域等同起来。如果在2周内没有检测到肿瘤生长, 请再次执行步骤1。请参见图 1。
注意: 肿瘤的存在也可以通过超声波进行评估。虽然目前还没有研究来评估从冷冻股票传播时肿瘤生长指标与新鲜库存的差异, 但我们的经验是, 冷冻股票肿瘤生长速度稍慢, 在新鲜库存之后就会被检测到反部分。无论如何, 这两种方法都应该在2周内产生可收获的肿瘤。 - 准备后肢肿瘤供体进行肿瘤收获。用 45 mg kg 的氯胺酮和 5 mg/kg 的木胺对兔子进行麻醉。静脉注射 (iv) 剂量的戊巴比妥钠的安乐死超过 390 mggskg。
- 一旦兔子被安乐死, 开始收获肿瘤, 通过删除皮肤和皮下组织覆盖肿瘤结节使用手术刀与刀与研究人员认为合适的刀片。请参见图 2。
- 一旦在后肢肌肉中发现肿瘤结节, 使用宽曲线边缘整体切除肿瘤。为此, 切断肌肉近端和远端的肌腱附着点, 然后沿着下骨追踪手术刀刀片。将被转移的标本暴露在肿瘤胶囊和坏死的情况下。请参见图 3。
注: vx2 肿瘤有高度坏死的核心。在收获肿瘤时, 一定要使用适当的眼睛保护和其他个人防护设备, 因为对肿瘤胶囊的任何损害都会导致坏死碎片的高压喷射。 - 用钝器 (如钳子、止血器) 轻轻刮伤坏死的核心, 以清洁肿瘤。这应该可以更好地可视化肿瘤胶囊和胶囊与周围肌肉之间的过渡点。请参见图 4。
- 从这个样本中, 收获几块大约 1\ u20122 毫米3肿瘤, 并立即将它们储存在一个装有室温无菌盐水的杯子中。
注: 这些肿瘤样本将用于随后的肝内植入。 - 将剩余的肿瘤放入无菌培养皿中, 用杜尔贝克的改良鹰培养基 (dmem) 沐浴。如果这个标本在冰上保持低温, 可以在 2\ u20123 h 后保存。
3. 通过腹腔切开术进行肝脏肿瘤植入术
- 准备接受的兔进行剖腹手术。使用 45 mg/kg 的氯胺酮和 5 mgkg xylazine 对受赠者的兔子进行诱导, 然后根据需要用 1%-3% 的异氟醚插管和维护。当兔子被麻醉时, 使用剪发器刮掉手术部位。用 betadine 磨砂、70% 乙醇溶液和 betadine 溶液清洗切口区域, 并以无菌手术方式覆盖腹部。
- 使用 #15 刀片, 通过从星形过程开始, 通过兔子的皮肤做一个小的向下垂直中线切口, 开始开腹手术。这应该很容易触诊, 而且往往大约是美国一分钱的大小。请参见图 5。
- 反射皮肤, 识别白纹。这应该是一个反射白带的组织在中线下低行。使用钝性解剖穿过白纹, 露出腹膜。请参见图 6。
注意: 腹膜很容易识别, 因为它将直接覆盖肠道, 可以看到呼吸运动。
注意: 由于表面张力, 腹膜往往附着在肠底。使用钝性创伤来解剖白纹有助于降低潜在肠道穿孔的风险。 - 一旦腹膜暴露出来, 仔细解剖, 进入腹腔。现在可以确定肝脏了。为了更好地导航腹部空间, 将中线切口 1\ 20122 厘米的下路延伸到皮肤、肌肉和腹膜。
注意: 通过小心地将弯曲的止血器插入腹膜空间, 弯曲的尖端朝腹膜表面朝外, 可以很容易、安全地完成中线切口。然后稍微打开止血器, 用刀片来可爱的组织之间的两个手臂的止血。 - 识别肝脏的左叶, 以便选择肿瘤植入的部位。左叶是内侧的内侧叶, 位于中线。
- 在试图将肝脏从腹膜空间中抽出来之前, 先在切口的下侧放置一块干纱布。
注意: 纱布将提供一个粘附表面, 使肝脏上的奠定, 以防止它收回回腹部。 - 使用手指上的耳垂或一块湿纱布 , 通过切口小心地将肝脏的左叶从腹部 , 并将其放置在较早放置的干纱布上。请参见图 7。
注意: 肝胶囊敏感, 容易破裂。它是至关重要的是要温柔, 当处理这个器官, 以防止胶囊出血, 肝擦伤, 和/或最终的腹腔。
注意: 通常情况下, 肝脏在进入腹膜空间时会在视觉上声明自己;然而, 如果兔子的胃扩张, 肝脏可以被推得离视线之外。如果是这种情况, 使用钝器探头轻轻抬起腹壁。在这种情况下, 肝脏倾向于坚持到腹侧的隔膜方面, 由于表面张力如此仔细地分离肝脏使用钝探针, 它应该分离。然后用阿图玛性钳把肝脏。 - 在这一点上, 准备植入肿瘤组织, 并在肝脏上放置一块湿纱布, 以保护它。
- 选择在第2.6 步中产生的 1\ u20122 毫米3块肿瘤组织, 用于植入肝脏。请参见图 8。
- 使用 #11 刀片, 在45°角刺穿肝脏组织, 使0.5 厘米深的口袋, 注意不要穿透肝脏囊的背侧。刺穿后, 把刀片留在原地。请参见图 9。
- 轻轻地将刀片朝腹侧抬起, 在肝脏床上创建一个小口袋。用钳子取肿瘤片, 将肿瘤片放在这个口袋里, 然后取出刀片。
注意: 刀片可以在插入肿瘤块之前取出, 但是, 肝脏会流血, 这可能会掩盖穿刺部位, 使其难以识别。
注意: 确保尽量减少肿瘤与任何其他结构的接触, 以防止无意的肿瘤播种。这也可以通过留出任何工具来帮助植入之后, 也可以避免。 - 此时, 在肿瘤口袋上放置一块止血剂, 如凝胶泡沫, 以促进止血, 防止肿瘤片被弹射。
- 一旦止血得到确认, 肝脏就会返回腹部。
- 用简单的连续针在锥形针上用3-0 多氧酮缝合关闭腹壁, 用4-0 多眼肌锡910缝合线关闭皮肤, 用连续的下角质层缝合切割针。
注意: 关闭腹壁时, 注意不要损坏缝合投掷中的大肠或其他肠结构。
注意: 虽然这个肿瘤将需要至少2周的明确的影像学识别, 它达到 1.5 \ 20122 厘米的大小直径在3周的生长。注意不要让肝脏肿瘤在 3.5 \ u20120124周后生长, 因为肿瘤会形成外生肿块, 并在当地积极扩散。
4. vx2 肿瘤悬浮液的制备
- 将40μm 过滤器放入50毫升锥形丙烯管的嘴中。使用2.7 步的肿瘤, 用 #15 刀片刮伤肿瘤表面, 收集可行的肿瘤, 并将这些刮伤放入过滤器中。
- 用 dmem 清洗活的肿瘤刮擦, 然后在 1600 rpm 离心丙烯管8分钟。
- 离心机完成后, 取出上清液并将其丢弃。然后以1:1 的体积比将甲基纤维素添加到剩余的细胞块中。
- 按照步骤 1.3 \ u20121.4 将此悬浮液注入后肢供体兔体内。将剩余的悬浮液放入1毫升的低温管中, 并将其冷冻在液氮中, 供以后使用。
5. vx2 肝肿瘤的血管造影利用
- 按照步骤3.1 中的说明准备兔子。
- 在腹股沟的股骨槽上触诊。当凹槽已被识别, 做一个 2\ u20123 沿凹槽的线性切口。请参见图 10。
- 采用钝性解剖, 定位和分离包含股静脉、动脉和神经的股骨束。请参见图 11。
- 再次, 使用钝性解剖将股动脉与束中的其他结构分离, 并将手术刀柄上的动脉隔离开来。请参见图 12。
- 使用 3-法语介绍套件, 利用 seldinger 技术获得访问与针。插入导丝并取出针头, 将 3-法国护套推进到容器中。请参见图 13。
注意: 避免在推进 3-法国护套时过度使用力, 因为这会导致股动脉横断。 - 在透视引导下, 使用导管、导丝和 iohexol 造影剂, 选择腹腔主干 (通常位于 t12 级), 然后通过普通肝和适当的肝脏将导管推进到左肝动脉。
- 此时, 通过导管管理所选择的代理。一旦给药, 取出导管。
- 采用3-0 丝缝合线, 将股动脉近端和远端连接到鞘的插入点。一定要拧紧靠近鞘的结, 因为它是提取, 以防止出血。
- 用切割针的4-0 聚近肌蛋白910缝合用硬皮下的针脚缝合腹股沟切口。
- 保持标准的术后护理, 并监测动物的恢复情况。根据需要使用标准技术进行安乐死和尸检。
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Representative Results
当看图 1, 很明显, 兔子的四头肌扩大。此外, 多个小的离散结节, 通常与肿瘤生长通过筋膜相关, 是可见的。触诊时, 注射肢体应出现比非注射肢体。如果研究人员需要更明确的肿瘤存在保证, 超声成像可以用来识别嵌入肌肉中的肿瘤。如果没有检测到肿瘤, 后肢应重新注射肿瘤细胞悬浮液。
为了确认成功的血管通路, 在抽吸时观察到血液返回鞘, 如图13d 所示。如果血管通路不成功, 尝试抽吸会产生空气在鞘或存在明显的阻力时, 拉注射器的柱塞。
对于肝脏肿瘤的生长, 有两种方法来确认成功的繁殖: 血管造影和尸检。在血管造影中, 肿瘤的识别可能会立即发生, 如图 14a中的情况, 其中肿瘤直接从肝常见动脉抽血。在肿瘤是侧向的情况下, 也可能需要一些时间, 如图14d 所示。如果肿瘤在向共同肝动脉注射对比后不容易看到, 研究人员应尝试向左、右肝动脉注入对比度, 以提高突出肿瘤的机会。它也可能有助于寻找异常动脉横向向肝脏的远端边缘, 如图14c 所示。在尸检时, 肿瘤应该很容易看到, 如图 15b所示 (与图 15B相比)。
图 1: 兔子后肢.剃须兔后肢, 有大量肿瘤生长的标志。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 暴露的后肢.同一肢体如图1所示, 覆盖皮肤, 显示出大量的血管扩张和变色, 不同于代表肿瘤位置的周围肌肉 (白色虚线)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 肿瘤被移除在整体内并被一分为二。(a)肿瘤和周围肌肉被整体切除。(b)肿瘤被一分为二, 以揭示其囊壁 (箭头) 和坏死核。肿瘤的过程可以在两个部分以及一些坏死的碎片中看到。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 肿瘤胶囊.箭头表示一块肿瘤 (t), 它是由肿瘤胶囊 (虚线白线) 从相邻的肌肉 (m) 中划定出来的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 公开的小线进程.皮肤和底层肌肉已被反射, 以允许可视化的小翼过程 (黑色箭头) 和肠道 (白色箭头)。白星表示颅骨方向。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: linea alba.覆盖的皮肤和筋膜已被反射, 以便可视化的linea alba (黑色箭头) 运行在颅骨到尾向方向。这个区域是无血管的, 提供了腹腔的失血。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 腹膜外的肝脏环状物.这张图片显示的是肝脏的一个叶, 从腹腔空间轻轻提取, 放在一块纱布上。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 植入术后的肿瘤片.在 #11 刀片的尖端旁边放置在片尖端旁边进行适当大小的肿瘤植入。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 在肝脏中创建一个用于肿瘤植入的口袋.# 11 刀片入到适当的深度在提取的肝脏的叶。这将为图 8中的肿瘤片的植入创建一个适当大小的口袋。请点击这里查看此图的较大版本.
图 10: 股骨槽和初始切口。(a)后肢的触诊允许股骨槽 (白色虚线) 的可视化。(b)沿股骨槽在后肢上的初始切口。请点击这里查看此图的较大版本.
图 11: 股骨束的鉴定.最初切口的钝器解剖显示股静脉 (黑色箭头)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12: 股束解剖和股动脉隔离。(a)股骨束的解剖使我们能够单独区分 (从左到右) 股静脉 (fv)、股动脉 (fa) 和股神经 (fn)。(b)在手术刀手柄上分离的股动脉。注意允许与股神经区分的血柱。请点击这里查看此图的较大版本.
图 13: 血管通路。(a)通过先前插入股动脉的通入针 (n), 将导丝 (g) 推进到股动脉 (fa) 中。(b)护套 (s) 和扩张器 (d) 在引导线 (g) 上推进到股动脉 (fa)。(c)鞘 (s) 和扩张器完全进入股动脉 (fa), 直至鞘集路。(d)在摘除扩张器和导丝后, 用丝绸固定护套。吸入在鞘里产生血 (黑箭)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 14: 肝肿瘤的血管造影成像。(a)导管尖端 (白色箭头) 将对比直接传递到喂肿瘤 (白星) 的动脉中。(b)导管尖端 (白色箭头) 将对比度传递到左肝远端动脉和侧侧肿瘤 (白星) 的适度对比吸收。(c)进一步对比注射到肿瘤从 b 显示异常动脉 (白线) 从导管 (白箭头) 到肿瘤 (白星)。(d)进一步对比度吸收后 b 的肿瘤。请点击这里查看此图的较大版本.
图 15: 兔肝脏。(a)健康的兔子肝, 显示左内侧叶 (白星) 在左侧叶 (黑星) 上。(b)兔肝, 肝发育完全 (白箭)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
vx2 肿瘤方法的第一个关键步骤是成功地在供体兔的后肢传播肿瘤。有关此步骤的详细信息, 请参阅 "代表性结果" 部分的第一段。
下一个关键步骤是确保正确识别可行的肿瘤胶囊。这不仅对肿瘤悬浮液的制备是必要的, 对肝植入的肿瘤碎片的选择和产生也很重要。图 4对活肿瘤和周围肌肉组织之间的界限进行了注释。如果在悬浮液制备过程中刮伤不正确的组织样本, 随后的后肢繁殖将失败。如果在肝植入过程中发生这种情况, 则不会发生肝脏中的肿瘤生长。这在血管造影之前是不明显的。
在肝植入过程中, 当接近肝脏的左叶时, 应小心。通常情况下, 如果肝脏是显而易见的, 当进入腹膜, 它实际上是肝脏的内侧叶, 操作人员正在观察。植入肝脏的内侧叶是血管造影使用的少数问题。首先是内侧叶与脊椎的解剖关系。内侧叶肿瘤往往会被脊柱在透视上混淆, 这使得肿瘤的确认和治疗变得困难。此外, 胃十二指肠动脉更经常与提供内侧叶的血管有关。这增加了非目标栓塞的肠道的风险, 并可能导致肠缺血/梗塞和可能死亡的动物。如前所述, 这不属于失败;然而, 它确实需要更多的护理, 在可视化和治疗。
最后的关键步骤是成功和稳定的股动脉访问。如图 12所示, 股动脉应隔离在手术刀刀片手柄上。虽然这样做主要是为了让研究人员更准确地执行 seldinger 技术20, 但它应该在整个过程中保持。这是因为, 一旦引入鞘, 取出手术刀手柄可能会导致血管内鞘的意外运动, 导致鞘闭塞, 并可能损坏血管和周围结构。如果鞘在手术过程中脱落, 在靠近进入部位的股骨槽中施加压力, 以止血, 然后动脉可以结扎。不要试图重新插入护套。研究人员可以尝试从对侧股动脉进入。
虽然 vx2 平台是目前用于肝癌翻译研究的一个稳健模型, 但它确实存在相关缺陷。这种模式的主要弱点是, 它的疾病状态并不模仿人类的 hcc。诱导的肿瘤在病理上与人肝癌并不相似, 非肝硬化肝实质微环境也不相似。此外, vx2 肿瘤显示有大量的内部坏死, 这就排除了这一模型用于治疗疗效研究。一些替代模型包括啮齿类动物模型, 如老鼠、老鼠和土木或更大的动物模型, 如猪和灵长类动物。16,21 . 这些备选办法都提供了不同的优点和缺点;然而, 作者认为, 在血管造影的利用和成本效应方面, vx2 兔仍然占主导地位。
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Disclosures
本报告所描述的工作得到了 guerbet llc 的研究赠款的支持。
Acknowledgments
我们要感谢伊利诺伊大学芝加哥生物资源实验室的兽医工作人员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MethoCult (Methycellulose) | Stemcell Technologies | M3134 | |
| VX2 Cell Line | NCI | VX-2 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 16 G Needle | BD | 305197 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| Hair Clippers | Wahl | 41870-0438 | |
| Foam Insulated Box | Mr. Box Online | 10 x 10 x 4 | |
| Acepromazine | Henry Schein | 003845 | |
| Buprenorphine | Par | 42023-179-05 | |
| Meloxicam | Henry Schein | 049755 | |
| Alcohol Pads | Covidien | 5033 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Xylazine | Akorn | 59399-110-20 | |
| Pentobarbital (Fatal-Plus) | Vortech | 9373 | |
| Sterile Petri Dish | Thermo Fisher | 172931 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Saline | Baxter | 2F7124 | |
| 15-Blade | Steris | 02-050-015 | |
| Scalpel Handle x 2 | Steris | 22-2381 | |
| Curved Hemostat | WPI | 501288 | |
| Atraumatic Forceps | Sklar | 52-5077 | |
| Gauze | Medline | NON21430LF | |
| 11-Blade | Steris | 02-050-011 | |
| Surgicel | Ethicon | 1951 | |
| 3-0 PDS / Taper | Ethicon | Z305H | |
| 4 - 0 Vicryl / Cutting | Ethicon | J392H | |
| 40 μm strainer | BD | 352340 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| plastic pipette | Thomas Scientific | HS206371B | |
| Centrifuge | Sorvall | 75004240 | |
| 1.40 mL Tubes (Internal Thread) | Micronic | MP32131-Z20 | |
| 3-F VSI Micro-HV Introducer Kit | Vascular Solutions | Custom Order (P15180391) | |
| .018 45° angle glidewire | Terumo | RG*GA1818SA | |
| Direxion bern-shape microcatheter | Boston Scientific | M001195230 | |
| Omnipaque | GE | Y510 |
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