转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测
Summary
我们提出了一个评估循环微 rna (mirna) 在癌症患者血浆样本中的表达水平的方案。特别是, 我们使用了商业上可用的循环 mirna 提取和逆转录酶试剂盒。最后, 我们使用实时预斑探针自定义板分析了一个由24个选定 mirna 组成的面板。
Abstract
人们对用于癌症诊断、预后和治疗监测的液体活检越来越感兴趣, 因此需要可靠和有用的生物标志物用于临床实践。在这里, 我们提出了一个方案, 提取, 逆转录酶和评估循环 mirna 的表达水平从血浆样本的结直肠癌 (crc)。微 rna (mirna) 是一类长度为18-25 核苷酸的非编码 rna, 它调节目标基因在平移水平上的表达, 并在生理病理中发挥重要作用, 包括促红细胞生成和抗血管生成功能。各种器官。mirna 在血清和血浆等生物液体中是稳定的, 这使得它们成为癌症诊断、预后和治疗决策及监测的理想循环生物标志物。循环 mirna 提取是使用一种快速有效的方法进行的, 该方法涉及有机方法和基于列的方法。对于 mirna 逆转录酶, 我们使用了一个多步骤的程序, 考虑了成熟 mirna 的 3 ‘ 时的多腺苷酸和 5 ‘ 处的适配器结扎, 然后是随机 mirna 预扩。我们选择了一个 24 mirna 自定义面板, 通过定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 进行测试, 并在阵列定制板上发现 mirna 探针。我们在实时 pcr 系统上进行了 qrt-pcr 板运行。使用 genorm 软件选择了用于规范化的家政中心 (第3.2 节)。使用表达套件软件 (v 1.1) 对数据进行分析, 并进行了统计分析。该方法被证明是可靠的和技术上稳健的, 可用于评估液体样品, 如血浆和血清中的生物标志物水平。
Introduction
crc 是全世界第三大最常见的恶性肿瘤和第四大癌症相关死亡原因。迄今为止, 贝伐单抗 (b), 一种针对血管内皮生长因子 (vegf) 和西妥昔单抗 (c) 或 panitumab (p) 的单克隆抗体, 已被批准用于一线治疗联合化疗 (ct) 方案。
k-ras和n-ras基因的突变是唯一能够识别最不可能从抗 egf ct 中受益的患者的临床有用生物标志物。虽然已经进行了几项研究, 以寻找生物标志物, 预测反应的基于 b 的 ct, 仍然严重缺乏可靠和有效的药物用于临床实践 1。
mirna 是小型 rna (长度为18-25 核苷酸), 调节目标基因的翻译, 并在包括胚胎和致癌在内的众多生理病理过程中发挥着至关重要的作用。这些分子在血浆血清、尿液和痰等生物液体中具有高度稳定性, 使其成为用于非侵入性取样的坚固生物标志物 2。利用参与血管生成途径的 mirna 面板, 我们的目标是确定新的循环生物标志物, 能够预测转移性 crc (mcrc) 患者的临床结果, 使用 b 基 ct 方案治疗。
我们分析了在前瞻性多中心随机三期试验 “意大利晚期结直肠癌试验” (itaca) 中使用 b 基 ct 治疗的52例 mcrc 患者。本议定书于2007年9月19日获得地方道德委员会 (comitato etico 地区 vasta e iestito 科学 romagnolo per lo studio e la cura dei tumori (irst) ircs, 第674号)。所有患者在采集血样前都给予了知情同意。对于每个患者, 在治疗前和第一次临床评估 (8周后) 收集静脉血液样本, 以评估基线 mirna 的表达及其在治疗过程中与患者结果相关的调节。
通过对文献的研究, 我们选择了21个与已知在人类血浆中检测到的血管生成过程相关的 mirna: has-msr-107, has-msr-126-3p, has-mil5-5p, has-mil-194-5p, has-mil-595-5 p, has-msr-200b-3p, has-myr-20b-5 p, has-mr-5p, has-m30-3p, has-mir-21-1 p, has-mir-24-3p, has-mra-27a-3p, has-m9b-3p, has-msr-5p, has-msr-424-5p, has-mid9-5p, has-mir-520d-3p, has-mir-92a-3p, has-m1-17-5p 和 has-mir-155 页。我们还选择了 has-mir-223p 和 has-miR-用于内源性归一化3、4、5、6和 cel-miR-, 从线虫中纯化, 作为外源归一化的尖峰。所有数据归一化都是使用 2 (ct) 方法执行的。
循环 mirna 的检测带来了一些技术上的困难, 因为分子在等离子体中的含量很低, 而且由于其序列较短, 其扩增具有化学挑战性。出于这些原因, 我们选择了一个既考虑苯酚有机萃取的程序, 也考虑了玻璃纤维柱学方法。循环 mirna 提取是液体活检领域的一个热门话题, 我们选择了一个商业试剂盒, 在恢复的 7,8的数量和质量方面已经被证明是最可靠的.我们选择了一种逆转转录 mirna 的协议, 在成熟的 mirna 的 5 ‘ 和 3 ‘ 的聚 (a) 尾添加一个适配器 (a) 尾, 以提高反应的选择性和特异性。
考虑到该方法的鲁棒性, 我们为 rt-pcr 设计了带有预斑探针的定制板, 以评估每个样本一式两份, 并分析了每个板内的2名患者, 如图 1所示。
Protocol
Representative Results
Discussion
mirna 是小型非编码 rna (长度为18-25 核苷酸), 能够结合其目标信使 rna 的 3 ‘ utr 区域并抑制和降解它。因此, 它们可以被认为是翻译水平上的基因表达调节剂。在过去的十年中, 一些 mirna 与癌症的发生和发展有关, 使其成为诊断、预后和治疗的有用临床生物标志物。在 rnase 的保护下, mirna 以稳定的形式存在于血液、血浆、血清、尿液和唾液等生物液体中, 这使得人们对其在临床实践中的</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了罗氏公司和意大利药品管理局 (aifa) 的部分资助。
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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