Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker
Summary
Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.
Abstract
Er is steeds meer belangstelling in vloeibare biopsie voor kanker-diagnose, prognose en therapeutische monitoring, de behoefte aan betrouwbare en nuttige biomarkers voor de klinische praktijk te maken. Hier presenteren we een protocol wilt ophalen, omgekeerde transcriberen en evalueren van de expressie niveaus van circulerende miRNAs uit plasma monsters van patiënten met een colorectaal carcinoom (CRC). microRNAs (miRNAs) vormen een klasse van niet-coderende RNAs van 18-25 nucleotiden in lengte die de uitdrukking van de doelgenen translationeel niveau regelen en spelen een belangrijke rol, met inbegrip van de pro – en anti-angiogenic functie, in de fysiopathologie van verschillende organen. miRNAs zijn stabiel in biologische vloeistoffen zoals serum en plasma, waardoor ze ideale circulerende biomarkers voor kanker-diagnose, prognose en behandeling besluitvorming en controle. MiRNA extractie circulerende werd uitgevoerd met behulp van een snelle en effectieve methode, waarbij zowel organische als kolom gebaseerde methoden. Voor miRNA retrotranscription gebruikten we een scriptingregel procedure dat polyadenylatie op 3′ en de afbinding van een adapter op 5′ van de volwassen miRNAs acht, gevolgd door willekeurige miRNA pre versterking. Wij een 24-miRNA aangepaste panel te worden getest door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) geselecteerd en de miRNA sondes gespot op matrix aangepaste platen. Wij uitgevoerd qRT-PCR plaat draait op een real-time PCR-systeem. Huishouden miRNAs voor normalisatie zijn gekozen aan de hand van de GeNorm software (v. 3.2). Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de software van de suite van de expressie (v 1.1) en statistische analyses werden uitgevoerd. De methode bleek te zijn betrouwbaar en technisch robuust en nuttig kan zijn voor het evalueren van biomerker niveaus in vloeibare monsters zoals plasma en/of serum.
Introduction
CRC vertegenwoordigt de derde meest voorkomende gediagnosticeerd maligniteit en de vierde oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Tot op heden zijn voor bevacizumab (B), een monoclonal antilichaam gericht tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), en cetuximab (C) of panitumumab (P), monoklonale antilichamen gericht tegen epidermale groeifactor receptor (EGFR), goedgekeurd eerstelijns behandeling in combinatie met chemotherapie (CT) regimes.
Mutaties in de genen van K-RAS en N-RAS zijn de enige klinisch nuttig biomarkers staat van identificatie van de patiënten die zijn minste kans om te profiteren van de anti-EGFR-gebaseerde CT. Hoewel verschillende onderzoeken zijn uitgevoerd om te zoeken naar biomarkers die voorspellende van reactie op B gebaseerde CT zijn, is er nog steeds een aanzienlijk gebrek aan betrouwbare en effectieve geneesmiddelen voor gebruik in de klinische praktijk1.
miRNAs zijn kleine RNAs (18-25 nucleotiden in de lengte) dat de vertaling van de doelgenen reguleren en een cruciale rol in tal van pathofysiologische processen, met inbegrip van de embryogenese en carcinogenese. Deze moleculen zijn zeer stabiel in biologische vloeistoffen zoals plasma/serum, urine en sputum, waardoor ze robuuste biomarkers voor niet-invasieve bemonstering2te gebruiken. Met behulp van een panel van miRNAs die betrokken zijn bij het angiogenic traject, wij gericht vast te stellen nieuwe circulerende biomarkers staat het voorspellen van klinische resultaten bij patiënten met metastatische CRC (mCRC) behandeld met B gebaseerde CT.
We analyseren van een reeks van 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT binnen de toekomstige multicentrische gerandomiseerde fase III trial “Italiaanse Trial in geavanceerde colorectaal carcinoom” (ITACa). Dit protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (Comitato Etico gebied Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (eerste) IRCCS, no. 674) op 19th September 2007. Alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming voordat bloed monster collectie. Voor elke patiënt, werden veneuze bloedmonsters verzameld vóór de behandeling en bij de eerste klinische evaluatie (na 8 weken) om basislijn miRNA expressie en haar modulatie tijdens behandeling met betrekking tot de patiënt resultaten te evalueren.
Via een zoekopdracht van de literatuur, die we geselecteerd 21 miRNAs gecorreleerd met het angiogenic-proces waarvan bekend is dat aantoonbaar in menselijk plasma: heeft-miR-107, heeft-miR-126-3 p heeft-miR-145-5 p, heeft-miR-194-5 p, heeft-miR-199a – 5p, heeft-miR-200b – 3p, heeft-miR-20b – 5p , heeft-miR-21-5 p, heeft-miR-210-3 p, heeft-miR-221-3 p, heeft-miR-24-3 p, heeft-miR-27a – 3p, heeft-miR – 29 ter – 3p, heeft-miR-335-5 p, heeft-miR-424-5 p, heeft-miR-497-5 p, heeft-miR – 520d – 3p, heeft-miR-92a – 3p, heeft-miR-17-5-p en heeft-miR-155-5 p. Wij ook geselecteerd heeft-miR-223-3 p en heeft-mir-484 endogene normalisatie3,,4,,5,6, en cel-miR-39 gezuiverd van C. elegans als een piek voor exogene normalisatie. Alle gegevens belangrijk waren uitgevoerd met behulp van de methode van de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
De detectie van circulerende miRNAs presenteert enkele technische problemen omdat de moleculen aanwezig op een zeer laag niveau in plasma zijn en hun versterking chemisch uitdagende gezien hun korte opeenvolging is. Wij hebben gekozen om deze redenen een procedure dat zowel organische extractie met fenol en een glasvezel kolom gebaseerde methodiek acht. Circulerend miRNA extractie is een hot topic op het gebied van vloeibare biopsie, en we kozen een commerciële kit die heeft aangetoond dat een van de meest betrouwbare in termen van hoeveelheid en de kwaliteit van de herstelde opbrengsten7,8. We kozen een protocol om te keren het transcriberen van miRNAs door de toevoeging van een adapter op 5′ en een poly(A) staart naar 3′ van de volwassen miRNA ter verbetering van de selectiviteit en de specificiteit van de reactie.
Gezien de robuustheid van de methode, wij ontwierp aangepaste borden met vooraf gevlekte sondes voor RT-PCR te beoordelen van elk monster in tweevoud en geanalyseerd 2 patiënten binnen elke plaat, zoals afgebeeld in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs zijn kleine niet-coderende RNAs (18-25 nucleotiden in lengte) staat de 3′ UTR regio van hun doel messenger RNA bindend en remmen en/of vernederende het. Zij kunnen dus gen expressie regelgevers op translationeel niveau worden beschouwd. In het laatste decennium, hebben verschillende miRNAs zijn gecorreleerd met kanker inleiding en ontwikkeling, waardoor ze nuttig klinische biomarkers voor diagnose, prognose en therapie. Beschermd door RNases, zijn miRNAs aanwezig in een stabiele vorm in biologische vloeistoffen zo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Roche S.p.A. en de Italiaanse geneesmiddelen Agentschap (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
