전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출
Summary
우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.
Abstract
거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3′ 5 ‘ 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.
K-RAS 및 N-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습1에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.
miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링2에 사용할 강력한 생체 그들을 렌더링 등 생물 학적 체액에서 매우 안정 된. 우리 식별 하기 위한 신생 통로에 관련 된 miRNAs의 패널을 사용 하 여, B 기반 CT 처방으로 치료 새로운 전이성 CRC (mCRC)를 가진 환자에 있는 임상 결과 예측할 수 있는 biomarkers를 순환.
52의 시리즈 분석 무작위로 예비 multicenter 내 B 기반 CT로 치료 하는 mCRC 환자 단계 III 예 심 “이탈리아 재판에 고급 대 장 암” (ITACa). 현재 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Comitato Etico 지역 Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo 당 소호 스튜디오 e 라 Cura 데이 Tumori (IRST) IRCCS, no. 674) 19회 2007 년 9 월에. 모든 환자는 혈액 샘플 수집 하기 전에 동의 했다. 각 환자에 대 한 정 맥 혈액 샘플 기준선 미르 식 및 환자 결과 관하여 치료 하는 동안 그것의 변조 치료 전과 (8 주) 후 첫 번째 임상 평가에서 수집 되었습니다.
문학의 검색을 통해 우리는 인간 플라스마에서 감지 것으로 알려져 있다 21 miRNAs 신생 프로세스와 상관을 선택: 있다-미르-107, 미르-126-3 p는-미르-145-5 p, 있다-미르-194-5 p, 있다-미르-199a-5 p, 있다-미르-200b-3 p, 있다-미르-20b-5 p 은-미르-21-5 p,-미르-210-3 p,-미르-221-3 p,-미르-24-3 p, 있다-미르-27a-3 p, 있다-미르-29b-3 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-424-5 p, 있다-미르-497-5 p, 있다-미르-520 d-3 p, 있다-미르-92a-3 p, 있다-미르-17-5 p는-미르-155-5 p. 우리는 또한-미르-223-3 p를 선택 하 고 있다-미르-484 생 정규화3,,45,6, 및 cel-미르-39 세 정규화에 스파이크도 C. 선 충 에서 정화. 모든 데이터 정규화 2 ̂ ̄(ΔΔCt) 메서드를 사용 하 여 수행 했다.
순환 miRNAs의 검출 분자 플라즈마에 매우 낮은 수준에서 존재 하 고 그들의 증폭은 화학적 도전 그들의 짧은 순서를 부여 하기 때문에 몇 가지 기술적인 어려움을 선물 한다. 이러한 이유로, 우리는 페 놀과 유기 추출 및 유리 섬유 열 기반 방법론을 고려 하는 절차를 선택. 미르 추출 순환 액체 생 검의 분야에서 뜨거운 주제 이며 우리가 선택 중 가장 신뢰할 수 있는 표시는 상업 키트 복구 된 수익률7,8의 품질과 금액. 우리는 반대 하는 프로토콜을 선택 miRNAs의 선택도 향상 시키기 위해 5’과 3 ‘ 성숙한 miRNA의 많은 꼬리에서 어댑터 추가 및 반응의 특이성에 의해 속기.
방법의 견고성을 감안할 때, 우리는 미리 발견 프로브 RT-PCR 중복에서 각 샘플을 평가 대 한 사용자 지정 접시를 설계 하 고 그림 1에서 보듯이 각 배지 내의 2 환자를 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3′ UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구로 기존과 이탈리아 약 기관 (AIFA)에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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