Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Abstract

Cellen voelen en reageren op lichamelijke signalen in hun omgeving door het omzetten van de mechanische prikkels in biochemically-detecteerbare signalen in een proces genaamd mechanotransduction. Een cruciale stap in mechanotransduction is de overdracht van krachten tussen de externe en interne omgevingen. Voor het verzenden van krachten, moet er een aanhoudende, ononderbroken fysieke koppeling gemaakt door een reeks van eiwit-eiwitinteractie. Voor een bepaald eiwit-eiwit interactie, mechanische belasting kan ofwel geen invloed hebben op de interactie, leiden tot sneller scheiding van de interactie, of zelfs stabiliseren de interactie. Begrip van hoe moleculaire belasting dicteert eiwit omzet in levende cellen kan waardevolle informatie bieden over de mechanische staat van een eiwit, op zijn beurt het ophelderen van haar rol in mechanotransduction. Bestaande technieken voor het meten van de kracht-gevoelige eiwitten dynamics gebrek aan directe metingen van eiwit lading of vertrouwen op de metingen uitgevoerd buiten de cellulaire context. Hier beschrijven we een protocol voor de terugwinning van Förster resonance energie overdracht-fluorescentie na photobleaching (FRET-FRAP) techniek, waarmee de meting van kracht-gevoelige eiwitten dynamiek binnen levende cellen. Deze techniek geldt potentieel voor elke FRET gebaseerde spanning sensor, bevordering van de studie van kracht-gevoelige eiwitten dynamiek in verscheidenheid van subcellular structuren en in verschillende soorten cellen.

Introduction

De extracellulaire omgeving is een rijke bron van zowel de fysieke als de biochemische signalen die cel gedrag bepalen. Met name kan de fysieke aard van de communicatie bemiddelen belangrijke cellulaire functies, met inbegrip van de celgroei, migratie en differentiatie^1,,^2,,^3,4. Disregulatie van de mechanica van de communicatie is een essentieel onderdeel te veel ziekten die nog geen voldoende behandelingen, zoals kanker⁵, atherosclerose⁶en⁷van de fibrose. Een volledig inzicht in hoe cellen converteren naar fysieke stimuli biochemically-detecteerbare signalen, een proces genoemd mechanotransduction, vereist de opheldering van het moleculaire mechanismen bemiddelen force transmission, zowel in als buiten de cellen en binnen meerdere subcellular structuren.

Binnen subcellular structuren, zijn eiwitten voortdurend draaien; binding en vrijblijvend gebaseerd op de sterkte van hun interacties met bindende partners⁸. Voor krachten toegezonden met succes over een fysieke afstand, moeten er een ongebroken ketting van eiwit-eiwitinteractie, wat betekent dat het een eiwit omzet langzaam genoeg moet te houden en te zenden van kracht tot en met haar bindende partner⁹. Terwijl eiwit-eiwitinteractie in het algemeen bestaan van verscheidene niet-covalente bindingen, met tussen de domeinen van de eiwitten, is de interactie vaak geconceptualiseerd als een gebonden staat die kan de overgang naar een niet-afhankelijke staat onder verschillende omstandigheden^{10, 11}. voor een bepaald eiwit-eiwit interactie, is het mogelijk dat de kracht geen effect op de levensduur van de interactie hebben kan, bekend als een “ideale band”, vermindering van de levensduur van de interactie, bekend als een “slip bond”, of verhogen de levensduur van de interactie , bekend als een “vangst bond”¹⁰. Er is dus een ingewikkelde relatie tussen eiwit belasting en eiwit dynamiek, die wij kracht-gevoelige dynamiek noemen.

Naar het begrip van het effect van belasting op bond dynamiek, zijn een aantal zeer informatieve experimenten uitgevoerd op het niveau van de single-molecuul. Met geïsoleerde eiwitten of fragmenten van eiwitten en manipulatie technieken zoals magnetische pincet, optisch pincet en atomic force microscopie, deze studies hebben aangetoond dat kracht-gevoelige eiwit-eiwitinteractie voor diverse relevante eiwitten^11,12. Beide integrins¹³ en cadherinen¹⁴, die zijn belangrijk voor het vormen van cel-cel en cel-matrix interacties, respectievelijk transmembraan eiwitten, is gebleken dat wijzigingen in dynamics verschuldigde te laden. Binnen de cel, vinculin tot en met beide talin¹⁵ en α-catenine¹⁶ is aangeworven in een kracht-afhankelijke manier en kan vormen een band van de vangst met actine¹⁷, die een cruciale rol voor vinculin op zowel focal verklevingen (FAs) en adherens verbindingen (AJs ) onder belasting. Single-molecuul studies toestaan voor de isolatie van specifieke eiwit-eiwitinteractie en eenduidige resultaten opleveren, maar ze geen rekening met de complexiteit van de cellulaire omgeving.

Landmark experimenten aangetoond dat verschillende subcellular structuren, met inbegrip van FAs en AJs, mechanosensitive en uitgebreide vergadering in reactie op intern gegenereerde of extern toegepast ladingen^{18,19, vertonen 20,21,22}. Bovendien hebben verschillende theoretische modellen voorgesteld dat mechanosensitive vergadering kon worden gedreven door kracht-gevoelige eiwitten dynamics^23,24,25. Om te onderzoeken deze kracht-gevoelige dynamiek binnen de levende cellen, zijn een paar indirecte benaderingen genomen. FRAP en verwante technieken bieden een relatief eenvoudige methodiek voor het meten van de dynamiek van eiwitten in cellen^26,27,28,29. Echter is de meting van eiwit belasting meer beperkt gebleven. Een typische aanpak is het vergelijken van de dynamiek van eiwitten in cellen met en zonder de blootstelling aan een cytoskeletal-remmer gebruikt ter vermindering van de algemene cel contractility^8,30,31. Conceptueel is dit een vergelijking tussen een hoge belasting en lage belasting staat. Echter, er is geen kwantificering van de belasting over de proteïne in beide staat, en kunnen er onbedoelde biochemische effecten van de Inhibitor van de omwenteling, die het verlies van belangrijke bandplaatsen langs een F-actine-filamenten. Een andere aanpak, specifiek voor FAs, geweest voor het meten van de totaalkracht inspanning op de drager vervagen door de FA gebruiken om tractie kracht microscopie geschatte moleculaire belasting te buigen over de relatie met de dynamiek van een enkele eiwit binnen de FA-³². Terwijl deze aanpak maakt het mogelijk voor de kwantificering van de totaalkracht, biedt het geen moleculair specifieke informatie. FAs zijn samengesteld uit meer dan 200 verschillende eiwitten, veel van die belasting³³kunnen dragen. Zo mogelijk meten van de output van de totaalkracht van een FA verduistert de mogelijkheid van meerdere kracht transmissie opleidingstrajecten en biedt geen betrouwbaar een zekere mate van belasting op een specifiek eiwit.

In tegenstelling tot eerdere benaderingen in mechanobiology, de komst van de FRET gebaseerde spanning sensoren kan direct meting van lasten ondervinden specifieke proteïnen in levende cellen^3635,34,. Hier presenteren we een protocol dat FRET gebaseerde spanning sensoren met FRAP gebaseerde maatregel van eiwit dynamiek combineert. We noemen deze techniek FRET-FRAP. Deze aanpak maakt het mogelijk de gelijktijdige meting van eiwit lading en de dynamiek van het eiwit, waardoor de beoordeling van de dynamiek van de kracht-gevoelige eiwitten in levende cellen (Figuur 1). Al, is de FRET-FRAP-techniek toegepast op de studie van de kracht-gevoelige dynamiek van de mechanische linker eiwit vinculin³⁷. Spanning sensoren zijn ontwikkeld voor talrijke proteïnen die relevant voor een verscheidenheid van subcellular structuren zijn. Bijvoorbeeld zijn sensoren ontwikkeld voor vinculin³⁴ en talin^38,39 in FAs, cadherinen en catenins in AJs^40,41,42, nesprin in de nucleaire LINC complex ⁴³, α-actinin⁴⁴ en filamin³⁶ in het cytoskelet en MUC-1 in de glycocalyx⁴⁵, o.a.⁴⁶. FRAP is ook dat een veelgebruikte techniek heeft geweest tweedehands voort mechanosensitive eiwitten binnen de focal verklevingen^8,31, adherens kruispunten⁴⁷actine cortex²⁶en nucleus⁴⁸. Vooruit, dat de FRET-FRAP techniek gelden in grote lijnen om het even welk van deze bestaande sensoren of nieuw ontwikkelde sensoren, waardoor voor de meting van de kracht-gevoelige dynamiek in een breed scala aan subcellular structuren en contexten. Voor dit doel bieden wij een gedetailleerde, gegeneraliseerde protocol voor de uitvoering van de FRET-FRAP techniek die van toepassing zijn in deze verschillende stelsels. Hopelijk, zal hierdoor een breed scala aan experimenten ophelderen van de functies van verschillende mechanosensitive eiwitten bij het reguleren van de transmissie van kracht en in het bemiddelen van cel gedrag.

Protocol

1. het genereren van monsters voor Imaging Sensor-constructie stabiel uitdrukkelijke spanning in gewenste celtype. Clone spanning sensor construct in pRRL vector- of andere virale expressie plasmide.Opmerking: Verscheidene verschillende moleculaire klonen hulpmiddelen zijn beschikbaar voor het bereiken van deze stap met inbegrip van het gebruik van enzymen van de beperking, extensie, en Gibson vergadering35laat overlappen. De vector pRRL wordt gebruikt in lenti virale transdu…

Representative Results

FRET-FRAP bestaat uit de combinatie van twee fluorescerende technieken, FRET en FRAP. Zoals we op de gevolgen van eiwit belasting gericht, we gebruikten FRET gebaseerde spanning sensoren34,46. Deze sensoren zijn vaak gebaseerd op een spanning sensing module bestaande uit twee fluorescente proteïnen, zoals mTFP1 en VenusA206K, verbonden door een flagelliform linker (figuur 1A). Wanneer de module wordt…

Discussion

De FRET-FRAP-methode zorgt voor directe meting van de kracht-gevoelige eiwitten dynamiek, een eigenschap die moeizaam direct sonde in levende cellen. De gevoeligheid van eiwit dynamiek met moleculaire belasting is cruciaal voor het eiwit de functie als een kracht zender of transducer. Laden is vereist voor de overdracht van zowel intern gegenereerde en extern toegepast krachten, genaamd mechanotransmission, en voor de omzetting van die krachten in biochemically-detecteerbare signalen, genaamd mechanotransduction. Echter,…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25300062
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
60x Objective NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Automated Stage	Prior Scientific	H117EIX3
Custom Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter	Chroma Technology Corp		ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium	Sapphire	MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D5796	with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30396.03
Fibronectin, Human	Corning	47743-654
FRAPPA Calibration Slide	Andor		provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser	Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Cells	ATCC	CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D6429
Inverted Fluorescent Microscope	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph for Olympus	Olympus
Micro-Humidification System	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Objective Heater Medium	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Envelope Plasmid	Addgene	12259
pRRL Vector			gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge	Thermo Fisher	75004505
Stable Z Stage Warmer	Bioptechs	403-1926
Venus Emission Filter	Semrock	FF01-571/72