JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

Abstract

תאים לחוש ולהגיב רמזים פיזי בסביבה שלהם על-ידי המרת גירויים מכניים אותות נסתרים מבחינה ביוכימית בתהליך הנקרא mechanotransduction. שלב חיוני ב- mechanotransduction הוא העברת הכוחות בין סביבות חיצוניים ופנימיים. לשדר הכוחות, חייב להיות מתמשך, רצופה הפיזי הצמדה שנוצרו על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון חלבון. אינטראקציה חלבון נתון, עומס מכני יכול לקבל שום השפעה על האינטראקציה, להוביל מהר יותר השיוך של האינטראקציה, או אפילו לייצב את האינטראקציה. הבנת איך מולקולרית עומס מכתיב מחזור חלבונים בתאים חיים יכולים לספק מידע יקר ערך על מצב מכני של חלבון, בתורו שחקרתי את תפקידו ב- mechanotransduction. קיימות טכניקות למדידת dynamics רגישים ל”כוח הפזורים חלבון או חוסר מדידות ישירה של עומס חלבון או להסתמך על המדידות שבוצעו מחוץ להקשר הסלולר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להתאוששות העברה-זריחה פורסטר תהודה אנרגיה לאחר photobleaching (סריג-FRAP) טכניקה, אשר מאפשר את המדידה של חלבון רגישים ל”כוח הפזורים הדינמיקה בתוך תאים חיים. טכניקה זו ישימה פוטנציאלי על כל חיישן מתח מבוסס סריג, בקידום המחקר של דינמיקה רגישים ל”כוח הפזורים חלבון במגוון מבנים subcellular, סוגי תאים שונים.

Introduction

הסביבה חוץ-תאי הוא מקור עשיר של סימנים ביוכימיים והן פיזית המכתיבים בהתנהגות התא. בפרט, הטבע הגופני של microenvironment יכולה לתווך תאיים מפתח, כולל צמיחת תאים, העברה של בידול1,2,3,4. Dysregulation של המכניקה של microenvironment הוא מרכיב קריטי למחלות רבות שאין להן עדיין טיפולים נאותים, כגון סרטן5, טרשת עורקים6ו פיברוזיס7. הבנה מלאה של מה תאים להמיר לגירויים פיזיים לאותות נסתרים מבחינה ביוכימית, תהליך הנקרא mechanotransduction, דורש הבהרה של המנגנון המולקולרי תיווכה כוח שידור, לתוך והן התאים ו בתוך מבנים subcellular מרובים.

בתוך מבנים subcellular, חלבונים משתנים כל הזמן איגוד, פעולת ההוצאה מהאוגדן המבוססת על האינטראקציות שלהם עם האיגוד שותפים8. עבור כוחות בהצלחה ישודרו על-פני מרחק פיזי, בטח יש שרשרת רצופה של אינטראקציות חלבון-חלבון, כלומר כי המחזור של חלבון חייבת להיות איטית מספיק לקיים ולשדר לכוח השותף שלה מחייב9. בעוד אינטראקציות חלבון-חלבון כלל מורכבות של מספר שאינו-קשרים הדדיים בין חלבון, האינטראקציה נתפסת לעתים קרובות כמדינה מאוגד יכול העוברות למצב לא מאוגד תחת תנאים שונים10, 11. לאינטראקציה חלבון נתון, זה אפשרי כי כוח יכולים להיות ללא השפעה על חייו של האינטראקציה, המכונה “בונד אידיאלי”, להפחית את אורך החיים של האינטראקציה, המכונה “קשר slip,” או להגדיל את אורך החיים של האינטראקציה , המכונה “לתפוס בונד”10. לפיכך, יש מערכת יחסים מורכבות בין עומס חלבון חלבון דינמיקה, אשר אנו מתייחסים כאל רגישים ל”כוח הפזורים דינמיקה.

לקראת הבנת ההשפעה של עומס על דינמיקה בונד, בוצעו מספר ניסויים מאוד אינפורמטיבי על רמת מולקולה בודדת. באמצעות חלבונים מבודד, או שברי חלבונים ו טכניקות מניפולציה כגון פינצטה מגנטי, מלקחיים אופטיים מיקרוסקופ כוח אטומי, מחקרים אלה הראו אינטראקציות חלבון רגישים ל”כוח הפזורים עבור מספר הרלוונטיים חלבונים11,12. שניהם אינטגרינים13 ו cadherins14, אשר חשוב עבור יוצרים אינטראקציות מטריצה תא ותא תא, בהתאמה transmembrane חלבונים, הראו שינויים ב- dynamics בשל כדי לטעון. בתוך התא, vinculin הוא גויס בשני talin15 וα-catenin16 באופן תלוי-כוח והוא יכול ליצור קשר לתפוס עם אקטין17, המציינת את תפקיד מכריע עבור vinculin-מוקד הדבקויות (FAs) והן adherens צמתים (AJs ) תחת עומס. מולקולה בודדת מחקרים לאפשר ניתוקה של אינטראקציות חלבון ספציפי להניב פירות ברורה וחד משמעית, אבל הם לא מהווים המורכבות של הסביבה התאית.

ציון דרך ניסויים הראו כי מספר מבנים subcellular, כולל FAs ו AJs, הן mechanosensitive, התערוכה הרכבה משופרת בתגובה נטען שנוצר באופן פנימי או חיצוני שהוחל18,19, 20,21,22. בנוסף, מספר מודלים תיאורטיים הראו כי מכלול mechanosensitive יכול להיות מונע על ידי כוח רגיש חלבון dynamics23,24,25. לבחון הדינמיקות האלה רגישים ל”כוח הפזורים בתוך תאים חיים, ננקטו כמה גישות עקיף. FRAP טכניקות הקשורות לספק מתודולוגיה פשוטה יחסית למדידת חלבון דינאמיקה של תאים26,27,28,29. עם זאת, המדד של עומס חלבון הוגבלה יותר. גישה אופיינית היא להשוות dynamics החלבון בתאים עם ובלי את החשיפה מעכב cytoskeletal להשתמש בהם כדי להפחית הכוללת תא contractility8,30,31. מבחינה מושגית, זוהי השוואה בין לעומס גבוה לבין המדינה עומס נמוך. עם זאת, יש אין כימות של העומס על פני החלבון במצב או, ייתכן שיש לא מכוונות אפקטים הביוכימי של המדכא, כגון אובדן של אתרי קישור מפתח לאורך נימה F-אקטין. גישה אחרת, ספיציפית FAs, כבר למדוד מאמץ כוח מוחלט על המצע על-ידי הפא באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה משוער עומס מולקולרית ולבחון את הקשר עם הדינמיקה של חלבון יחיד בתוך הפא32. בעת גישה זו מאפשרת כימות של הכוח הכולל, אינה מספקת מידע מולקולרי ספציפי. FAs מורכב של מעל 200 חלבונים שונים, רבים מהם יכול לשאת עומס33. לפיכך, מדידת הפלט כוח מוחלט של הפא פוטנציאל מטשטש את האפשרות של מסלולים שידור כוח מרובים, לא אמין לספק מידה של עומס על חלבון ספציפי.

בניגוד גישות הקודם ב- mechanobiology, כניסתו של מתח מבוסס סריג חיישנים מאפשר ישיר מדידה של המון מנוסים על ידי חלבונים ספציפיים בתוך החיים תאים34,35,36. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב מתח מבוסס סריג חיישנים מבוססי FRAP מדד של חלבון דינמיקה. אנו מתייחסים טכניקה זו כאל FRAP סריג. גישה זו מאפשרת את המדידה בו זמנית של עומס חלבון ואת הדינמיקה חלבון, ובכך מאפשר את ההערכה של דינמיקת רגישים ל”כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים (איור 1). . כבר, הטכניקה סריג-FRAP הוחל במחקר של הדינמיקות רגישים ל”כוח הפזורים של vinculin חלבון37מקשר מכני. המתח חיישנים פותחו חלבונים רבים הרלוונטיים במגוון מבנים subcellular. לדוגמה, חיישנים פותחו עבור vinculin34 / talin38,39 FAs, cadherins catenins AJs40,41,42, nesprin ב הלינק גרעיניים מורכבים 43, α-actinin44 , filamin36 , שלד התא, ו- MUC-1 ב- glycocalyx45, בין היתר46. בדומה, FRAP הוא שטכניקה נפוץ שימש על mechanosensitive חלבונים בתוך8,הידבקויות מוקד31, צמתי adherens47, קליפת אקטין26, ואת גרעין48. לנוע קדימה, שהטכניקה FRAP סריג צריך להיות בהרחבה החלים על כל אלה חיישנים קיימים או לאחרונה פיתחה חיישנים, המאפשר המידות של דינמיקה רגישים ל”כוח הפזורים במגוון רחב של מבנים subcellular והקשרים. למטרה זאת, אנו מספקים נתונים היסטוריים, כללית פרוטוקול ליישום הטכניקה סריג-FRAP ישים במערכות שונות אלו. בתקווה, זה יאפשר מגוון רחב של ניסויים שחקרתי את התפקידים של חלבונים mechanosensitive שונים בוויסות כוח שידור, מתווכים בהתנהגות התא.

Protocol

1. ליצור את דוגמאות עבור הדמיה לבנות חיישן המתח stably אקספרס בסוג התא הרצוי. לשבט לבנות חיישן המתח וקטור pRRL או אחרים פלסמיד ביטוי ויראלי.הערה: מספר כלים שיבוט מולקולרי שונים זמינים להשיג את שלב זה כולל שימוש אנזימי הגבלה, חופפים סיומת ולאחר ההרכבה גיבסון35. וקטור pRRL מש?…

Representative Results

סריג-FRAP מורכב של השילוב של שתי טכניקות פלורסנט, דאגה, FRAP. כפי התמקדנו השפעת עומס חלבון, השתמשנו מתח מבוסס סריג חיישנים34,46. חיישנים אלה מבוססים בדרך כלל על מתח חישה מודול בהיקף של שני חלבונים פלורסנט, כגון mTFP1 ו- VenusA206K, המחוברים באמצעות מקשר (lin…

Discussion

השיטה סריג-FRAP מאפשרת מדידה ישירה של חלבון רגישים ל”כוח הפזורים דינמיקה, מאפיין זה היה קשה לחקור ישירות בתוך תאים חיים. הרגישות של חלבון דינמיקה מולקולרית לטעון חיוני לתפקוד החלבון כוח המשדר או מתמר. טעינת נדרש עבור השידור של שניהם שנוצר באופן פנימי, שהוחל מבחוץ כוחות, נקרא mechanotransmission, וזה ע?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמך על ידי פרס הקריירה קרן המדע הלאומית (ה-NSF-CMMI-14-54257) כמו גם מענקים American Heart Association (16GRNT30930019), מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM121739-01) זכה ד ר הופמן ברנטון, אזרח מדע קרן בוגרת מחקר לאגודה מוענק קת’רין רוטנברג. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של ה-NSF או NIH.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Force-sensitive Protein DynamicsFluorescent TechniquesMechanobiologyVinculinTalinCadherinsNesprinTension Sensor ConstructFibronectinFRAP LaserAcceptor FluorophoreMechanically-sensitive ProteinsCell-cell InteractionsCell-environment InteractionsMolecular ScaleLiving Cells
check_url/58619?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image