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Bioengineering

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

Abstract

Les cellules détectent et répondent à des stimuli physiques dans leur environnement en convertissant des stimuli mécaniques en signaux biochimiquement détectables dans un processus appelé la mécanotransduction. Une étape cruciale dans la mécanotransduction est la transmission des forces entre les environnements externes et internes. Pour transmettre des forces, il doit y avoir une liaison physique soutenue et ininterrompue, créée par une série d’interactions protéine-protéine. Pour une interaction protéine-protéine donnée, charge mécanique ne peut non plus avoir aucun effet sur l’interaction, entraîner une dissociation plus rapide de l’interaction, ou même stabilise l’interaction. Comprendre comment moléculaire charge dicte de renouvellement des protéines dans les cellules vivantes peut fournir des informations précieuses sur l’état mécanique d’une protéine, à son tour élucider son rôle dans la mécanotransduction. Les techniques existantes pour mesurer la dynamique des protéines sensibles à la force n’ont pas des mesures directes de la charge protéique ou s’appuient sur les mesures effectuées en dehors du contexte cellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la récupération Förster resonance energy transfert-fluorescence après photoblanchiment (FRAP-frette) technique, qui permet la mesure de la dynamique des protéines sensibles à la force dans des cellules vivantes. Cette technique est potentiellement applicable à n’importe quel capteur de tension axée sur la frette, facilitant l’étude de la dynamique des protéines sensibles à la force dans diverses structures subcellulaires et dans différents types de cellules.

Introduction

L’environnement extracellulaire est une source riche d’indices biochimiques et physiques qui régissent le comportement de la cellule. En particulier, la nature physique du microenvironnement peut médier principales fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire, migration et différenciation1,2,3,4. Le dérèglement de la mécanique du microenvironnement est une composante essentielle pour beaucoup de maladies qui n’ont pas encore de traitements adéquats, tels que le cancer5, athérosclérose6et7de la fibrose. Bien comprendre comment les cellules convertissent des stimuli physiques en signaux détectables biochimiquement, un processus appelé mécanotransduction, exige l’élucidation des mécanismes moléculaires médiation transmission de force, dans et hors des cellules et au sein de plusieurs structures subcellulaires.

À l’intérieur des structures subcellulaires, les protéines sont tournent constamment la liaison et la séparation basée sur la force de leurs interactions avec les partenaires8de fixation. Pour les forces à être transmis avec succès à travers une distance physique, il doivent y avoir une chaîne ininterrompue d’interactions protéine-protéine, ce qui signifie que le chiffre d’affaires de la protéine doit être suffisamment lente pour maintenir et transmettre la force à son partenaire de liaison9. Alors que les interactions protéines-protéines sont généralement consistent de plusieurs non-liaisons covalentes entre les domaines de la protéine, l’interaction est souvent conceptualisée comme un État lié qui peut passer à un État indépendant sous différentes conditions10, 11. pour une interaction protéine-protéine donnée, il est possible que la force peut avoir no effet sur la durée de vie de l’interaction, connue comme un « bond idéal », réduire la durée de vie de l’interaction, connue comme un « lien de glissement » ou augmenter la durée de vie de l’interaction , connu comme un « bond de capture »10. Ainsi, il y a une relation entre charge protéique et la dynamique des protéines que nous désignons comme sensibles à la force dynamique.

Vers la compréhension de l’effet de la charge sur la dynamique de liaison, un certain nombre d’expériences très instructifs ont été réalisé au niveau de la molécule unique. À l’aide de protéines isolées, ou fragments de protéines et de techniques de manipulation comme magnétique pincettes, pinces optiques et microscopie à force atomique, ces études ont démontré les interactions protéines sensibles à la force pour plusieurs pertinentes protéines11,12. Les deux intégrines13 et cadhérines14, qui sont des protéines transmembranaires importants pour former des interactions cellule-matrice et les cellules, respectivement, ont montré des altérations dans la dynamique due pour charger. Au sein de la cellule, vinculine est recruté pour les deux talin15 et α-caténine16 en fonction de la force et peut former une liaison de catch avec l’actine17, indiquant un rôle crucial pour la vinculine adhérences focales (FAs) et jonctions adherens (AJs ) sous charge. Études de molécules simples permettant l’isolement des interactions protéine-protéine spécifique et donnent des résultats sans ambiguïté, mais ils ne tiennent pas compte de la complexité de l’environnement cellulaire.

Point de repère expériences ont démontré que plusieurs structures subcellulaires, dont le syndrome et AJs, sont mécanosensibles et pièce Assemblée améliorée en réponse aux charges interne ou externe appliqué18,19, 20,21,22. En outre, plusieurs modèles théoriques ont suggéré que l’Assemblée mécanosensibles pourrait être pilotée par protéines sensibles à la force dynamique23,24,25. Pour examiner ces dynamiques sensibles à la force dans des cellules vivantes, quelques approches indirectes ont été prises. PAF et les techniques connexes fournissent une méthode relativement simple pour mesurer la dynamique des protéines en cellules26,27,28,29. Toutefois, la mesure de la charge de la protéine a été plus limitée. Une approche classique consiste à comparer la dynamique des protéines dans les cellules avec et sans l’exposition à un inhibiteur du cytosquelette utilisé pour réduire l’ensemble cellule contractilité8,30,31. Sur le plan conceptuel, il s’agit d’une comparaison entre une charge élevée et un état de faible charge. Cependant, il n’y a aucune quantification de la charge dans l’ensemble de la protéine dans aucun des États, et il peut y avoir des effets biochimiques involontaires de l’inhibiteur, telle la perte de sites de fixation clés le long d’un filament d’actine F. Une autre approche, spécifique au FAs, a consisté à mesurer l’effort de force totale sur le substrat par la FA à l’aide de la microscopie à force traction approximative charge moléculaire et d’examiner la relation avec la dynamique d’une seule protéine au sein de la FA32. Tandis que cette approche permet la quantification de l’ensemble de la population, il ne fournit pas des informations moléculaires spécifiques. SAF est constitués de plus de 200 protéines différentes, dont beaucoup peuvent supporter la charge33. Ainsi, mesurer l’intensité de la force totale d’une FA potentiellement obscurcit la possibilité de plusieurs voies de transmission de force et fiable, ne fournit pas une mesure de la charge sur une protéine spécifique.

Contrairement aux approches antérieures en mécanobiologie, l’avènement des capteurs de tension axée sur la frette permet directement les cellules de mesure des charges subies par les protéines spécifiques à l’intérieur de vie34,35,,36. Nous présentons ici un protocole qui associe des capteurs de tension axée sur la frette FRAP-mesure de la dynamique des protéines. Nous appelons cette technique FRAP-frette. Cette approche permet la mesure simultanée de la charge protéique et de la dynamique des protéines, ce qui permet l’évaluation de la dynamique des protéines sensibles à la force dans les cellules vivantes (Figure 1). Déjà, la frette-FRAP technique a été appliquée à l’étude de la dynamique de la force-sensibles de l’éditeur de liens mécaniques protéine vinculine37. Capteurs de tension ont été développées pour nombreuses protéines qui sont pertinentes dans une variété de structures subcellulaires. Par exemple, les capteurs ont été développés pour la vinculine34 et talin38,39 FAs, cadhérines et caténines AJs40,41,42, nesprin dans le complexe de LINC nucléaire 43, α-actinine44 et filamine36 dans le cytosquelette et MUC-1 dans le glycocalyx45, entre autres46. De même, le FRAP est qu’une technique couramment utilisée a été utilisée sur les protéines de mécanosensibles dans les adhérences focales8,31, adherens jonctions47, actine cortex26et noyau48. Aller de l’avant, que la frette-FRAP technique devrait être largement applicable à l’un de ces capteurs existants ou nouvellement développé capteurs, permettant les mesures de la dynamique de la force-sensibles dans une grande variété de contextes et de structures subcellulaires. À cette fin, nous fournissons un protocole détaillé, généralisé de mise en oeuvre de la technique de la frette-FRAP applicable dans ces différents systèmes. J’espère que cela permettra une grande variété d’expériences élucider les rôles de diverses protéines de mécanosensibles dans la régulation de transmission de la force et dans la médiation de comportement de la cellule.

Protocol

1. générer des échantillons pour l’imagerie Stablement express tension capteur construct dans type de cellule souhaité. Cloner tension capteur construct dans pRRL vecteur ou autres plasmides d’expression virale.Remarque : Plusieurs outils de clonage moléculaires différents sont disponibles pour réaliser cette étape, y compris l’utilisation des enzymes de restriction, se chevauchent extension et Gibson Assemblée35. Le vecteur pRRL est utilisé dans lenti transd…

Representative Results

FRETTE-FRAP est constitué de la combinaison de deux techniques fluorescents, vous inquiétez pas et PAF. Comme nous nous sommes concentrés sur les effets de la charge de la protéine, nous avons utilisé axée sur la frette tension capteurs34,46. Ces capteurs sont souvent basés sur une tension de détection module composé de deux protéines fluorescentes, tels que mTFP1 et VenusA206K, reliés par un éditeur de liens flagellif…

Discussion

La méthode FRAP-frette permet une mesure directe de la dynamique des protéines sensibles à la force une propriété qui a été difficile de sonder directement à l’intérieur de cellules vivantes. La sensibilité de la dynamique des protéines à charge moléculaire est essentielle aux fonctions de la protéine comme un transmetteur de force ou un transducteur. Chargement est nécessaire pour la transmission des deux interne et forces appliqué extérieurement, appelé mechanotransmission et pour la conversion de c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une bourse de la National Science Foundation carrière (NSF-CMMI-14-54257) ainsi que les subventions accordées par l’American Heart Association (16GRNT30930019) et le National Institutes of Health (R01GM121739-01) décerné à m. Brenton Hoffman et un ressortissant Science Foundation recherche bourse d’études supérieures accordé à Katheryn Rothenberg. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NSF ou NIH.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
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