JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Mätning av kraft-känsliga Protein Dynamics i levande celler med hjälp av en kombination av fluorescerande tekniker

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för samtidig användning av Förster resonans energi överföring-baserade spänning sensorer för att mäta protein belastning och fluorescens återhämtning efter fotoblekning att mäta protein dynamics möjliggör mätning av kraft-känslig protein dynamiken inom levande celler.

Abstract

Celler känna och reagera på fysiska ledtrådar i deras miljö genom att omvandla mekanisk stimuli till biokemiskt-detectable signaler i en process som kallas mechanotransduction. Ett avgörande steg i mechanotransduction är överföringen av krafter mellan de yttre och inre miljöerna. Att överföra krafter, det måste finnas en ihållande, obruten fysisk koppling som skapas av en serie av protein-protein interaktioner. För ett visst protein-protein interaktioner, mekanisk belastning kan antingen har ingen effekt på samverkan, leda till snabbare disassociation av interaktionen, eller ens stabilisera interaktionen. Förstå hur molekylära belastning dikterar protein omsättningen i levande celler kan ge värdefull information om det mekaniska tillståndet av ett protein, som i sin tur belysa dess roll i mechanotransduction. Befintliga tekniker för att mäta kraft-känsliga protein dynamics antingen saknar direkta mätningar av protein belastning eller förlita sig på de mätningar som utförs utanför det cellulära sammanhanget. Här beskriver vi ett protokoll för Förster resonans energi överföring-fluorescens återhämtning efter fotoblekning (bandet-FRAP) teknik, som möjliggör mätning av kraft-känsliga protein dynamiken inom levande celler. Denna teknik är potentiellt tillämpliga på någon bandet-baserade spänning sensor, att underlätta studiet av kraft-känsliga protein dynamics i mängd subcellulära strukturer och i olika celltyper.

Introduction

Den extracellulära miljön är en rik källa till både biokemiska och fysiska ledtrådar som dikterar cell beteende. Särskilt kan den fysiska naturen i närmiljön medla viktiga cellulära funktioner, inklusive celltillväxt, migration och differentiering1,2,3,4. Dysreglering av mekaniken i närmiljön är en kritisk komponent för många sjukdomar som ännu inte har tillräcklig behandlingar, såsom cancer5, åderförkalkning6och fibros7. En fullständig förståelse av hur celler omvandlar fysiska stimuli till biokemiskt-detectable signaler, en process som kallas mechanotransduction, kräver förtydligandet av de molekylära mekanismer som medla kraft överföring, både in och ut ur cellerna och inom flera subcellulära strukturer.

Inuti subcellulära strukturer vänder proteiner ständigt över; bindande och uppdelningen baserat på styrkan i deras interaktioner med bindande partner8. För krafter överförs framgångsrikt över fysiska avstånd, måste det finnas en obruten kedja av protein-protein interaktioner, vilket innebär att en proteinets omsättning måste vara långsam nog att bevara och överföra kraft till dess bindande partner9. Medan protein-protein interaktioner består vanligen av flera icke-kovalenta bindningar mellan protein domäner, konceptualiseras samspelet ofta som en bunden stat som kan övergå till en obunden stat under olika villkor10, 11. för ett visst protein-protein interaktioner, är det möjligt att kraft kan har ingen effekt på livslängden av interaktionen, känd som en ”perfekt bond”, minska livslängden på interaktionen, känd som en ”slip bond”, eller öka livslängden på samspelet , känd som en ”catch bond”10. Således finns det ett intrikat förhållande mellan protein belastning och protein dynamik, som vi kallar kraft-känsliga dynamics.

För att förstå effekten av belastning på bond dynamics, har ett antal mycket informativ experiment utförts på nivån singel-molekyl. Med isolerade proteiner eller fragment av proteiner och manipulation tekniker såsom magnetiska pincetter, optisk pincett och atomic force microscopy, har dessa studier visat kraft-känsliga protein-protein interaktioner för flera relevanta proteiner11,12. Båda integriner13 och cadherins14, som är transmembrana proteiner viktiga för att bilda cell-matrix och cell-cell interaktioner, respektive, har visat förändringar i dynamics på grund för att ladda. I cellen, vinculin rekryteras till båda talin15 och α-catenin16 i en kraft-beroende sätt och kan bilda fångst med aktin17, indikerar en avgörande roll för vinculin på både fokal sammanväxningar (FAs) och adherens föreningspunkter (AJs ) under belastning. Singel-molekyl studier tillåta för isolering av specifika protein-protein interaktioner och ge entydiga resultat, men de hänsyn inte till komplexiteten i den cellulära miljön.

Landmärke experiment visat att flera subcellulära strukturer, inklusive FAs och AJs, är mechanosensitive, och uppvisar förbättrad församlingen svar på internt genererad eller externt appliceras laster18,19, 20,21,22. Flera teoretiska modeller har dessutom föreslagit att mechanosensitive församlingen kunde drivas av kraft-känsliga protein dynamics23,24,25. För att undersöka dessa kraft-känsliga dynamiken inom levande celler, har några indirekta metoder vidtagits. FRAP och relaterade tekniker ger en relativt enkel metod för att mäta protein dynamics i celler26,27,28,29. Mätning av protein belastning har dock varit mer begränsad. En typisk metod är att jämföra protein dynamics i celler med och utan exponering för en cytoskeletal-hämmare används för att minska totala cell kontraktilitet8,30,31. Begreppsmässigt är detta en jämförelse mellan en hög belastning och låg belastning. Dock finns det ingen kvantifiering av belastningen över proteinet i antingen tillstånd, och det kan finnas oavsiktliga biokemiska effekter av hämmaren, sådan förlusten av viktiga bindande platser längs en F-aktin filament. Ett annat tillvägagångssätt, specifika för FAs, har varit att mäta total kraft ansträngning på substraten av FA använder dragkraft force microscopy ungefärliga molekylär belastning och undersöka förhållandet med dynamiken i ett enda protein inom FA32. Medan detta tillvägagångssätt möjliggör kvantifiering av totala kraften, ger den inte molekylärt specifik information. FAs består av över 200 olika proteiner, av vilka många kan bära lasten33. Således mäta total kraft utdata från en FA potentiellt skymmer möjligheten att flera kraft överföring vägar och på ett tillförlitligt sätt ger inte ett mått på belastningen på ett specifikt protein.

Till skillnad från tidigare metoder i Mekanobiologi, tillkomsten av bandet-baserade spänning sensorer kan direkt mätning av laster upplevs av specifika proteiner inuti levande celler34,35,36. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar bandet-baserade spänning sensorer med FRAP-baserade mått av protein dynamics. Vi hänvisar till denna teknik som bandet-FRAP. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig mätning av protein belastning och protein dynamik, vilket möjliggör bedömning av kraft-känsliga protein dynamiken i levande celler (figur 1). BANDET-FRAP tekniken har redan tillämpats till studien av kraft-känsliga dynamiken i de mekaniska linker protein vinculin37. Spänning sensorer har utvecklats för många proteiner som är relevanta i en mängd olika subcellulära strukturer. Till exempel har sensorer utvecklats för vinculin34 och talin38,39 i FAs, cadherins och catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleära LINC komplexa 43, α-actinin44 och filamin36 i cytoskelettet och MUC-1 i de glykokalyx45, bland annat46. Likaså är FRAP en vanligt förekommande teknik har använts på mechanosensitive proteiner inom focal sammanväxningar8,31, adherens föreningspunkter47, aktin cortex26och nucleus48. Framåt, bandet-FRAP tekniken bör vara allmänt tillämpliga på någon av dessa befintliga sensorer eller nyligen utvecklat sensorer, vilket möjliggör mätningar av kraft-känsliga dynamik i en mängd olika subcellulära strukturer och sammanhang. Detta slutet tillhandahåller vi en detaljerad, generaliserad protokoll för att genomföra bandet-FRAP tekniken tillämpas i dessa olika system. Förhoppningsvis kan en mängd olika experiment klarlägga roller olika mechanosensitive proteiner reglerar kraft överföring och medla cell beteende.

Protocol

1. generera prover för Imaging Stabilt express spänningar sensorn construct i önskad celltyp. Klona spänningar sensorn konstruktion i pRRL vektor- eller andra virala uttryck plasmid.Obs: Flera olika molekylär kloning verktyg finns att åstadkomma detta steg inklusive användning av restriktionsenzym, överlappar förlängning, och Gibson församlingen35. PRRL vektorn används i lenti viral transduktion och möjliggör en betydande grad av proteinproduktion med hjälp av …

Representative Results

BANDET-FRAP utgörs av kombinationen av två fluorescerande tekniker, FRET och FRAP. Som vi fokuserat på effekterna av protein belastning, använde vi bandet-baserade spänning sensorer34,46. Dessa sensorer är ofta baserade på en spänning avkänning modul bestående av två fluorescerande proteiner, såsom mTFP1 och VenusA206K, ansluten med en flagelliform länkare (figur 1A). När modulen är pla…

Discussion

BANDET-FRAP metoden möjliggör direkt mätning av kraft-känsliga protein dynamics, en egenskap som har varit svårt att direkt söka inuti levande celler. Känsligheten av protein dynamics och molekylär belastning är kritiska till proteinets funktion som en kraft sändare eller givaren. Lastning krävs för överföring av både internt genererade och externt-tillämpad styrkor, kallas mechanotransmission, och för omvandlingen av dessa styrkor till biokemiskt-detectable signaler, som kallas mechanotransduction. Men …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av en National Science Foundation karriär Award (NSF-CMMI-14-54257) samt bidrag från American Heart Association (16GRNT30930019) och National Institutes of Health (R01GM121739-01) tilldelas Dr Brenton Hoffman och en nationell Science Foundation Graduate Research Fellowship tilldelas Katheryn Rothenberg. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NSF eller NIH.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Force-sensitive Protein DynamicsFluorescent TechniquesMechanobiologyVinculinTalinCadherinsNesprinTension Sensor ConstructFibronectinFRAP LaserAcceptor FluorophoreMechanically-sensitive ProteinsCell-cell InteractionsCell-environment InteractionsMolecular ScaleLiving Cells
check_url/58619?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image