Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Store ovenfra og ned Proteomikk bruker kapillær sone geleelektroforese Tandem massespektrometri

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58644
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En detaljert protokoll er beskrevet for separasjon, identifikasjon og karakterisering av proteoforms i protein prøver ved kapillær sone geleelektroforese-electrospray ionization-tandem massespektrometri (CZE-ESI-MS/MS). Protokollen kan brukes for høy oppløsning karakterisering av proteoforms i enkle protein prøver og store identifikasjonen av proteoforms i komplekse proteom prøver.

Abstract

Kapillær sone geleelektroforese-electrospray ionization-tandem massespektrometri (CZE-ESI-MS/MS) har blitt anerkjent som et nyttig verktøy for topp-ned Proteomikk som mål å karakterisere proteoforms i komplekse proteomes. Men anvendelsen av CZE--MS-/ MS for store ovenfra og ned Proteomikk har blitt hindret av den prøven lasting kapasiteten og begrense separasjon vindu av CZE. Her, beskrives en protokoll bruker CZE--MS-/ MS med et mikroliter skala eksempel lasting volum og en 90 minutters separasjon vindu for store ovenfra og ned Proteomikk. CZE--MS-/ MS plattformen er basert på en lineær polyakrylamid (LPA)-belagt separasjon kapillær med ekstremt lav electroosmotic flyt, en dynamisk pH-krysset-baserte online prøve konsentrasjon metode med høy effektivitet for protein stabling, en Electro-kinetically pumpet skjede flyt CE-MS grensesnitt med ekstremt høy følsomhet og en ion felle masse spectrometer med høy masse oppløsning og skanning fart. Plattformen kan brukes for høy oppløsning karakterisering av enkel intakt protein prøver og store karakterisering av proteoforms i ulike komplekse proteomes. Som et eksempel, er en svært effektiv separasjon av en standard protein blanding og svært følsom gjenkjenning av mange urenheter bruker plattformen vist. Eksempel denne plattformen kan produsere over 500 proteoform og 190 protein-IDer fra en Escherichia coli proteom i en enkelt CZE-MS/MS kjøre.

Introduction

Ovenfra og ned Proteomikk (TDP) mål for store karakterisering av proteoforms innen en proteom. TDP avhengig effektivt væske-fase separasjon av intakt proteiner før electrospray ionization-tandem massespektrometri (ESI-MS/MS) analyse på grunn av høy kompleksiteten og stor konsentrasjon dynamisk område av proteom1,2 ,3,4,5. Kapillær sone geleelektroforese (Sweden) er en kraftfull teknikk for separasjon av biomolecules basert på deres størrelse-til-lade prosenter6. CZE er relativt enkel, som krever bare en åpen rørformet-smeltet silica kapillær, en bakgrunn elektrolytt (BGE) og en strømforsyning. Et utvalg av intakt proteiner kan lastes inn av kapillær press eller spenning, og separasjon startes ved å fordype begge ender av kapillær i BGE og bruke en høy spenning. CZE kan nærme ultrahøy separasjon effektivitet (> millioner teoretisk plater) for separasjon av biomolecules7. CZE-MS har en drastisk høyere følsomhet enn brukte reverseres-fase flytende kromatografi (RPLC)-MS for analyse av intakt proteiner8. Selv om CZE-MS har et stort potensial for store ovenfra og ned Proteomikk, har dets bredt program i Proteomikk blitt hindret av flere problemer, inkludert eksempel lasting kapasitet og smale separasjon-vinduet. Typisk eksempel lasting volum i CZE er ca 1% av det totale kapillære volumet, som vanligvis tilsvarer mindre enn 100 nL9,10,11. Vinduet separasjon av CZE er vanligvis mindre enn 30 min på grunn av den sterke electroosmotic flyt (EOF)9,10. Disse problemene begrense CZE-MS/MS for identifikasjon av en rekke proteoforms og lav rikelig proteoforms fra en kompleks proteom.

Mye innsats har blitt gjort å forbedre utvalget lasting volumet av CZE via online prøve konsentrasjon metoder (f.eks, solid-fase microextraction [SPME]12,13, forbedret sikkerhet feltet prøve stabling [FESS]9 , 11 , 14, og dynamisk pH krysset15,16,17,18). FESS og dynamisk pH junction er enklere enn SPME, bare krever en betydelig forskjell mellom eksempel bufferen og BGE i ledningsevne og pH. FESS benytter en prøve-buffer med mye lavere ledningsevne enn BGE, fører til en stabling av analytter på grensen mellom sonen utvalg og sonen BGE i av kapillær. Dynamisk pH krysset benytter en grunnleggende eksempel plugg (f.eks, 50 mM ammonium bikarbonat, pH 8) og en syrlig BGE (f.eks, 5% [v/v] eddiksyre, pH 2.4) på begge sider av prøven. Ved anvendelse av en høy positiv spenning etter injeksjon av kapillær oppstår titrering av grunnleggende eksempel, fokuserer på analytter til et stramt plugg før under en CZE separasjon. Nylig gruppen solen systematisk forhold FESS og dynamisk pH junction online stablingsrekkefølgen til Behold proteiner, demonstrere at dynamisk pH krysset kunne produsere mye bedre ytelse enn FESS for online konsentrasjonen av intakt proteiner når eksempel injeksjon volumet var 25% av totalvolumet kapillær19.

Nøytralt belagt separasjon kapillærene (f.ekslineær polyakrylamid [LPA]) har vært ansatt å redusere EOF i kapillær, sakker CZE separasjon og utvide separasjon vinduet20,21. Nylig utviklet gruppen Dovichi en enkel prosedyre for utarbeidelse av stabil LPA belegg på den indre veggen i kapillærene, utnytte ammonium persulfate (APS) som oppretter og temperatur (50 ° C) for frie radikaler produksjon og polymerisasjon22 . Nylig, gruppen solen ansatt LPA-belagt separasjon kapillære og dynamisk pH krysset metoden for CZE separasjon av intakt proteiner, nå en mikroliter skala prøve lasting volum og en 90 minutters separasjon vinduet19. CZE systemet åpner døren å bruke CZE--MS-/ MS for store ovenfra og ned Proteomikk.

CZE-MS krever en svært robust og sensitive grensesnitt til par CZE til MS. Tre CE-MS-grensesnitt har blitt godt utviklet og kommersialisert i historien om CE-MS, og de er co-aksial skjede-flow grensesnitt23, sheathless grensesnittet bruker et porøst tips som ESI emitter24, og electro-kinetically pumpet skjede flyt grensesnitt25,26. Electro-kinetically pumpet skjede-flyt-grensesnitt-baserte CZE-MS/MS har nådd en lav zeptomole peptid oppdagelsen grense9, over 10 000 peptid-IDer (IDs) fra HeLa celle proteom i en enkelt kjøre14, rask karakteristikk intakt proteiner11og svært stabil og reproduserbar analyserer biomolecules26. Nylig ble av LPA-belagt separasjon kapillær, dynamisk pH krysset metoden og elektro-kinetically pumpet skjede flyt grensesnittet brukt for store ovenfra og ned Proteomikk av en Escherichia coli (E. coli) proteom19 ,27. CZE--MS-/ MS plattformen nærmet over 500 proteoform IDer i en enkelt kjøre19 og nesten 6000 proteoform IDer via kopling med størrelse-utestenging kromatografi (SEC)-RPLC fraksjoneres27. Resultatene viser tydelig evnen til CZE--MS-/ MS for store ovenfra og ned Proteomikk.

Her, er en detaljert prosedyre ved å bruke CZE--MS-/ MS store ovenfra og ned Proteomikk beskrevet. CZE--MS-/ MS systemet benytter av LPA-belagt kapillær å redusere EOF i kapillær, metoden dynamisk pH knutepunkt for online konsentrasjonen av proteiner, elektro-kinetically pumpet skjede flyt grensesnittet for kopling CZE til MS, en orbitrap masse Spectrometer for innsamling av MS og MS-/ MS spektra av proteiner, og en TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identifikasjon og karakterisering) programvare for proteoform ID via databasesøk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av LPA belegg på den indre veggen av separasjon Capillary

  1. Forbehandling av av kapillær
    1. Tømme en smeltet silica kapillær (120 cm i lengde, 50 µm i indre diameter [ID], 360 µm i ytre diameter [OD]) suksessivt med 500 µL av 1 M natriumhydroksid, deionisert vann, 1 M saltsyre, deionisert vann og LC-MS klasse metanol bruker en sprøytepumpe.
    2. Tørke av kapillær med nitrogen gass (10 psi, ≥ 12t) og fyll av kapillær med 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate i metanol bruker en sprøytepumpe. Seal begge ender av kapillær med silica gummi og ruge det ved romtemperatur for minst 24 timer.
      Merk: I dette trinnet er den indre veggen i av kapillær functionalized med C = C. lenger inkubasjon resulterer i bedre kapillær belegg på grunn av en mer komplett reaksjon.
    3. Skjær en liten del (~ 5 mm) av capillary fra begge ender med cleaving stein. Skyll av kapillær med metanol (500 µL) bruker en Sprøytepumpe for opprydding Ureagert reagenser. Tørk av kapillær med nitrogen gass (10 psi, ≥12 h).
  2. Utarbeidelse av LPA-belegg
    Merk: Denne fremgangsmåten er basert på Zhu et al. 22 med mindre modifikasjoner.
    1. Forberede en akrylamid løsning (40 mg av akrylamid i 1 mL vann) og ammonium persulfate (APS) løsning (5% [w/v] i vann).
    2. Legge 2-3 µL av APS løsningen til 500 µL av akrylamid løsningen, virvle blandingen, og degas det med nitrogen gass i 5 min fjerne oksygen i løsningen.
    3. Legg blandingen i av forbehandlet kapillær bruker et vakuum, forsegle begge ender av kapillær med silica gummi og ruge det i et vannbad ved 50 ° C i 40 minutter.
    4. Fjern en liten del (~ 5 mm) av av kapillær fra begge ender med cleaving stein. Skyv Ureagert løsningen av kapillær med vann (200 µL), bruke sprøytepumpen.
      Merk: Kontroller polymer skjøvet ut av av kapillær er en agarose gel-lignende konsistens. Litt lengre inkubering (opptil ~ 45-50 minutter) kan føre til en bedre kapillær belegg. Med lengre reaksjon perioder av kapillær kan bli blokkert og høyt trykk er nødvendig for å presse ut polymer med vann. En såkalt HPLC pumpe kan brukes til dette formålet.

2. etsing av kapillær med flussyre

Advarsel: Bruk passende sikkerhetsprosedyrer mens håndtering flussyre (HF) løsninger. Alle HF-relaterte operasjoner må gjøres i en kjemisk hette. Kontroller at 2,5% kalsium gluconate gel er tilgjengelig for bruk i eksponering før HF-relatert operasjon. Doble hansker er nødvendig, en typisk nitril inne og en tung neopren hanske utenfor. Bruk en labfrakk og vernebriller. Etter HF operasjonene, holde flytende og fast spesialavfall separat. Flytende HF avfall må nøytraliseres umiddelbart med en høy-konsentrasjon natriumhydroksid løsning for midlertidig lagring før avfall pick-up. HF-avfall må lagres midlertidig i en plastbeholder som med to tykk plast en gallon Ziploc poser og lokk. Både faste og flytende avfall må merkes riktig.

  1. Brenne en porsjon av kapillær med en mild flamme (f.ekslomme lettere) å fjerne de ytre polyimid (pi) belegget (1 cm i lengde) ca 4 cm fra én ende av av kapillær. Forsiktig rengjøre brent delen av av kapillær ved å tørke å fjerne polyimid (pi) belegg helt.
    Merk: Fortsett med forsiktighet, som delen av av kapillær uten polyimid (pi) belegg vil være litt skjør.
  2. Bore et hull på slutten av en 200-µL rør rundt samme størrelse som kapillær ytre diameter å tilstrekkelig holde av kapillær på plass når den er koblet gjennom dette hullet. Tråd slutten av kapillær som er nær delen brent gjennom hullet til delen brent i røret.
    Merk: Det anbefales å teste størrelsen på hullet med slutten av kapillær fra delen brent for å sikre riktig størrelse, brent delen av av kapillær er skjøre.
  3. Legg ~ 150 µL av HF (48-51% løsning i vann) til 200-µL røret slik at HF løsningen er halvveis opp delen brent på av kapillær. Inkuber av kapillær i HF løsningen ved romtemperatur i 90-100 min.
    Merk: Det anbefales at et hull opprettes i lokket på røret og noen små objektet (f.eks, en liten pipette tips) til å holde opp røret mens inkubering pågår. Pipetter spissen kan brukes å punktere skum eller noen andre solid plattform som reaksjon kammeret kan henge fra, skape et trygt miljø. Plasser papirhåndklær under røret med HF og følger riktig framgangsmåte ved utslipp.
  4. Fjerne av kapillær fra røret og vask utvendig med deionisert vann for å fjerne eventuelle gjenværende HF.
    Merk: Kontroller at ytre diameter av kapillær på den smaleste delen av brent er nå mindre enn 100 µm, som det skal være.
  5. Klipp den etset delen av kapillær midt på den smaleste delen bruke cleaving stein til å produsere en separasjon kapillær med mindre enn 100 µm i OD i den ene enden. Kutt ikke etset nederst av kapillær å få en 1-m separasjon kapillær.
    Merk: Kast HF avfall i henhold til institusjonelt foreskrevet protokollen.

3. forberedelse av prøvene

  1. Utarbeidelse av en standard protein blanding
    1. Forbered en standard protein blanding som inneholder cytochrome c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lysozyme (14,3 kDa, 0,1 mg/mL), β-kasein (24 kDa, 0.4 mg/mL), myoglobin (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), karbonsyre anhydrase (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) og storfe serum albumin (BSA, 66.5 kDa 1.0 mg/mL) i LC-MS Vurder vann som en lagerløsning.
      Merk: Lager løsningen kan være aliquoted og lagret på-80 ° C for bruk.
    2. Fortynne lager løsningen med en faktor på 10 med en 50 mM ammonium bikarbonat løsning (pH 8.0) i LC-MS klasse vann for CZE-MS analyse.
      Merk: Filtrere ammonium bikarbonat løsningen før bruk med en membran filter (f.eks, 0,2 µm cellulose nitrat membran og 50 mm i diameter).
  2. Utarbeidelse av en E. coli prøve
    1. Kultur E. coli (K-12 MG1655) celler i LB medium på 37 ° C mens riste på 225 rpm til OD600 verdien nærmer seg 0,7. Samle E. coli celler viasentrifugering (3,283 x g, 10 min) og vaske dem flere ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fjerne mediet.
    2. Suspendere E. coli cellene i lyseringsbuffer inneholder 8 M urea, proteasehemmere og 100 mM ammonium bikarbonat (pH 8.0) og ultrasonicate på isen i 15 min bruker en ultralyd celle disruptor med en kopp horn for komplett celle lysis.
      1. Satt Driftssyklus (%) til 50 og sette Utgang kontroll til 7 for ultralyd celle disruptor.
    3. Sentrifuge lysate 18 000 x g for 10 min. samle nedbryting og kast pellet. Bruke en liten aliquot nedbryting av proteinet konsentrasjon måling med bicinchoninic syre (BCA) analysen.
      Merk: Lysate må fortynnes minst med en faktor på tre til redusere urea konsentrasjon lavere enn 3 M for å bli forenlig med BCA analysen. BCA analysen utføres basert på produsentens prosedyre.
    4. Mix 1 mg av E. coli proteiner med kaldt aceton med Volumforholdet 1:4 og holde blandingen på 20 ° C over natten til å fremkalle proteiner.
      Merk: Utfør alle eksperimenter med aceton i kjemisk hette.
    5. Nedspinning utfelt proteiner (12 000 x g, 5 min) og fjerne nedbryting. Vask pellets med kaldt aceton igjen (samme volum som før) og spinne ned igjen.
    6. Fjern nedbryting og tillate pellet tørke i kjemisk panseret for et par minutter.
      Merk: Ikke overdry til protein pellets.
    7. Oppløse den utfelt E. coli proteiner (1 mg) i 200 µL av 8 M urea i 100 mM ammonium bikarbonat (pH 8.0).
    8. Denature, redusere og alkylate prøven.
      1. Inkuber prøven på 37 ° C i 30 minutter til denature proteiner.
      2. Redusere med dithiothreitol (DTT) ved å legge 2 µL av 1 M DTT løsning (i 100 mM ammonium bikarbonat) i utvalget og rugende prøven på 37 ° C i 30 min.
      3. Alkylate proteiner med iodoacetamide (IAA) ved å legge til 6 µL av 1 M IAA løsning (i 100 mM ammonium bikarbonat) til prøven og ruge utvalget for 20 min i romtemperatur i mørket.
      4. Slukke overflødig IAA med DTT ved å legge til 2 µL av 1 M DTT løsning og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Syre prøven med maursyre (FA) for å få en endelig FA konsentrasjon av 1% (v/v).
        Merk: Reduksjon og alkylation utføres for å hjelpe den unfolding av protein for nedstrøms fragmentering. Disse trinnene vil miste informasjon av disulfide obligasjoner. Hvis målet er å studere disulfide obligasjoner på proteiner, unngå disse trinnene. Husk å håndtere alle konsentrert syre løsninger i en kjemisk hette.
    9. Desalt prøven bruker en C4 felle kolonne (f.eks, 4 mm fra ID, 10 mm i lengde, fullpakket med 3-µm partikler har 300-Å porene) med en såkalt HPLC-system. Bruke en UV-detektor på en bølgelengde på 254 nm for gjenkjenning.
      1. Infusjonshastigheten mobile fase som satt til 1 mL/min. aktivere kolonnen rødme det med 80% (v/v) acetonitrile (ACN), 0,1% FA i vann i 10 min, og equilibrate av rødme det med 2% (v/v) ACN, 0,1% FA i vann i 10 min.
      2. Laste 500-µg proteiner til kolonnen og desalt av flushing dem med 2% (v/v) ACN, 0,1% FA i vann i 10 min på en 1 mL/min flow rate.
      3. Elute proteiner med 80% (v/v) ACN, 0,1% FA i vann i 3 minutter på en 1 mL/min flow rate. Samle eluate og lyophilize det med en vakuum konsentrator.
        Merk: C4 felle kolonnen kan brukes til desalt store mengder proteiner men ikke lav mikrogram proteiner på grunn av mulig utvalg tap. For begrenset protein materialer, vurdere å bruke pipette-spisser med C4 medier for protein avsalte. Pass på at du ikke overdry proteiner når lyophilizing prøven.
    10. Løses på 500 µg proteiner (forutsatt ingen prøve tap under eksempel utarbeidelsen) i 250 µL av 50 mM ammonium bikarbonat (pH 8.0) for CZE-MS eksperimenter.

4. oppsett av CZE--MS-/ MS systemet og analyse av prøvene

  1. Oppsett av CZE
    1. Forberede en BGE som inneholder 5% eller 10% (v/v) Eddiksyre (pH ~2.4 eller ~ 2.2) i LC-MS Vurder vann. Inn ~1.5 mL av BGE BGE ampuller som samsvarer med bufferbrettet av CZE-autosampler.
      Merk: Gjør frisk BGE hver uke og endre BGE løsningen i ampullen hver dag å unngå enhver kontaminering.
    2. Legge en prøve løsning (5-200 µL) til en sett inn-rør og legge sett inn røret i en prøve medisinglass thatmatches med eksempel brett av CZE-autosampler.
    3. Belaste prøven, BGE og separasjon kapillær i CZE-autosampler.
      Merk: Språket som brukes i denne protokollen mest nøyaktig gjenspeiler bruken av en bestemt autosampler (se Tabell for materiale), men prinsippene kan brukes på andre autosamplers.
      1. Velg eksempel laste på siden manuell kontroll i CZE-autosampler. Legg BGE ampullen i bufferbrettet av autosampler, noterte sin posisjon i bufferbrettet. Legg eksempel ampullen i eksempel skuffen med autosampler, noterte sin posisjon i eksempel skuffen.
        Merk: Apparatet kan benyttes i manuell kontroll ved å klikke på bildet av instrumentet for Enheten skjerm siden hovedinstrument og deretter velge manuell under Direkte kontroll.
      2. Legg av separasjon kapillær i CZE autosampler, bruker ikke-etset nederst av kapillær. Sett autosampler justering posisjon med manuell kontroll. Tråden non-etset nederst av kapillær inn i et hull som brukes til å holde separasjon kapillær før det ikke kan være fysisk koblet videre.
        Merk: I dette tilfellet slutten av av kapillær er nesten på samme høyde som slutten av elektroden minst 50 µL av utvalget kreves eksempel ampullen sørge for slutten av av kapillær ligger i eksemplet under injeksjon. Hvis prøven volumet er lav (dvs., 5 µL), høyden på innsetting utgangen på kapillære må justeres som beskrevet i trinn 4.1.3.2.1.
        1. Juste høyden på hele injeksjon av kapillær hvis prøven volumet er lavere enn 50 µL (dvs., 5 µL). Slå av autosampler til Standby med manuell kontroll. Skriv inn prøveposisjon i systemet og flytte av kapillær til prøven. Skyv hele injeksjon av kapillær videre ned nå bunnen av prøven ampullen.
          Merk: I dette tilfellet, prøve injeksjon kan utføres med et utvalg av bare 5 µL i ampullen.
      3. Fortsetter å bruke den manuelle kontrollen, flush av kapillær med BGE for 20 min, med et trykk på 20 psi.
  2. Oppsett av CZE-MS grensesnittet
    1. Trekke en Borosilikatglass kapillær (1 mm i OD, 0,75 mm ID, 10 cm lang) i to electrospray emittere med en orifice 20-40 µm i OD
      Merk: Holde lengden på electrospray emitter som 4-5 cm og kutt den med en cleaving stein om nødvendig. Kast alle glass i en beholder. Innstillingene for å få 20 til 40 µm tips er som følger: Angi varmen til 498, trekk til 5, hastigheten til 10, forsinkelsen 150 og presset til 200. Kontroller størrelsen på emittere med et mikroskop før bruk. Justere parametere litt om nødvendig.
    2. Montere en kommersiell electro-kinetically pumpet skjede flyt grensesnitt (se Tabell of Materials) til forsiden av det masse spectrometer. Fyll skjede buffer tanken med en buffer med 10% (v/v) metanol og 0,2% (v/v) FA i LC-MS klasse vann.
    3. Skyll T i grensesnittet med den skjede buffer via pressmiddel manuelt med en sprøyte. Tre 1-mm-OD slutten av en electrospray sender gjennom en ermet rør og koble emitter med én port av den Tvia en passende. Bare skyll T manuelt igjen med en sprøyte fylle emitter med slire bufferen.
    4. Justere avstanden mellom hullet av emitter og inngangen til masse spectrometer ~ 2 mm ved hjelp av kameraet som av grensesnittet. Bruke en 2 - til 2.2-kV spenningsnivået skjede buffer ampullen for electrospray. Justere spray spenning for å oppnå en stabil electrospray.
      Merk: Hvis ingen electrospray eller en ustabil electrospray er observert, se grensesnittet for å sikre at det er ingen store bobler i emitter, Tog slangen som brukes til å koble skjede buffer ampullen og T. Avstanden mellom hullet av emitter og masse spectrometer inngangen kan være grovt estimert ved å sammenligne den med 1 mm OD til emitter. Spray spenningen er avhengig av størrelsen på emitter. For 20 - 40 µm emittere er 2-2.2 kV god nok. Husk å alltid være forsiktig når du bruker høye spenninger.
    5. Slå av spray spenningen og forsiktig tråd etset slutten av separasjon kapillær gjennom T i emitter før det ikke kan bli skjøvet ytterligere. Bruke et lavt trykk (dvs., 5 psi) etter injeksjon av kapillær under denne prosessen sørge for det er ingen bobler i av kapillær.
      Merk: Av kapillær er koblet til T via en ermet rør og en passende. Juster plasseringen av etset nederst av kapillær i emitter ved hjelp av kameraet innenfor 500 µm. Avstanden kan være grovt estimert ved å sammenligne den med 1 mm OD til emitter.
    6. Stopp lavtrykk etter injeksjon av kapillær. Skyll emitter litt med slire bufferen. Igjen, bruke 2-2.2 kV spray spenning for å teste spray.
  3. Oppsett av CZE metode for eksempel injeksjon, separasjon, kapillære rødme og følge av den masse spectrometer for datainnsamling
    1. Velg ny under fil -rullegardinsmenyen på Hovedinstrumentet skjermen for å starte en ny metode.
    2. Velg vik som SV/EV, brett som eksempel, press som 5 psi, KV som 0 og varighet som 95 s en eksempel injeksjon.
      Merk: Utvalget injiseres i den kapillære via pressmiddel. Eksempel injeksjon volumet kan beregnes basert på press og injeksjon tid bruker Poiseuilles lov. For eksempel 5 psi for en 95-s eksempel injeksjon tilsvarer ca 500 nL eksempel lasting volum for en 1-m lange separasjon kapillær (50-µm ID).
    3. Velg parametere for CZE separasjon og definere parametere for utløsing av datainnsamling.
      1. Angir vik som InV, brett som Buffer, press som 0 psi, KV som 30 og varighet som 4200 s for separasjon av standard protein blanding prøven. Angir mengden som InV, brett som Buffer, press som 0 psi, KV som 20 og varighet som 6,600 s for separasjon av E. coli proteom prøven.
        Merk: Spenningen brukes for separasjon kan bli justert basert på prøven kompleksiteten. For enkle protein prøver, 30 kV kan brukes for å fremskynde analysen. For komplekse prøver, 20 kV brukes til å avta separasjon og få mer MS-/ MS spectra for proteoform IDer.
      2. Angi parametere for utløser datainnsamling under Tidsbestemte hendelser. Angi tid (s) som 0,0 og Type som Relay 1 for Aktiver i trinn 1. Angi klokkeslettet (s) 1.0 og Type som Relay 1 for Deaktiver i trinn 2.
    4. Velg vik som InV, brett som Buffer, press som 10 psi, KV som 30 og varighet som 600 s kapillær rødme.
    5. Lagre metoden filene for CZE-MS og MS-/ MS eksperimenter.
  4. Oppsett av MS og MS-/ MS
    1. Angi parametrene MS og MS-/ MS for intakt protein analyse ved hjelp av en quadrupole-ion felle masse spectrometer (se Tabell for materiale).
      Merk: Positivt ion modus og høyere energi collisional dissosiasjon (HCD) for fragmentering er ansatt.
      1. Justere melodi fil: aktivere intakt protein-modus og bruke et overtrykk Trykk på 0,2. Angi ion overføring kapillær temperatur 320 ° c og s-linse RF nivået til 55.
      2. Bygge filen MS og MS-/ MS metoden.
        1. For full MS, angi antall microscans 3, oppløsningen til 240 000 (på m/z 200), automatisk få kontroll (AGC) målverdien 1E6, maksimal injeksjon tiden til 50 ms og skanneområde til 600-2000 m/z.
      3. For MS-/ MS, bruker du data-avhengige oppkjøp ("BMH") for de åtte mest intense ionene i et bredt spekter av MS. Sett vinduet isolasjon til 4 m/z og normalisert collisional energi (NCE) til 20%. Angi antall microscans til 1, oppløsning til 120,000 (på m/z 200), AGC målverdien til 1E5 og maksimal injeksjon tiden til 200 ms.
      4. Angi intensiteten terskelverdien for utløser fragmentering på 1E5 og sette ionene med en kostnad stat høyere enn 5 isoleres for fragmentering. Slå på ekskludere isotoper og sett dynamiske utelukkelse 30 s.
        Merk: Antall microscans for MS-/ MS kan økes til 3. I dette tilfellet kan Top3 DDA metode brukes for å redusere syklustiden.
    2. Definere en kablet tilkobling mellom CE autosampler og masse spectrometer for automatisk følge av datainnsamling. Koble en ende av en wire til stafett 1 kontakt A og videresende 1 kontakt B på baksiden av CE-autosampler. Koble den andre enden av kabelen til Start i - og starter i + på siden av det masse spectrometer.
  5. CZE--MS-/ MS eksperiment og analyse av prøvene
    1. Bruke 30 kV med håndstarten CE på eksempel injeksjon slutten og 2-2.2 kV på skjede buffer ampullen bruke ekstern strømforsyning til å teste separasjon kapillære og electrospray.
      Merk: Separasjon gjeldende, i dette tilfellet er rundt 8-9 µA hvis 5% (v/v) eddiksyre brukes som BGE.
    2. Angi en data oppkjøpet sekvens på masse spectrometer datamaskinen ved å velge en ny sekvens.
      1. Velg Ukjent som eksempel og angi et filnavn og bane. Angi MS skal brukes for hvert utvalg kjøre under Instrument metoden.
        Merk: Siden det er en egen datamaskin for å kontrollere CE autosampler, prøveposisjon trenger ikke angis her.
    3. Definere en CZE separasjon sekvens på CE datamaskinen å angi buffer plasseringen og prøveposisjon metoden CZE. For å starte en ny sekvens, velg rekkefølge under rullegardinmenyen analyse på siden hovedinstrument.
    4. Start anskaffelsesmetoden data på masse spectrometer datamaskinen først ved å velge sekvens (eller løpe prøven for enkelt går). Deretter start CE rekkefølgen på CE autosampler datamaskinen.
      Merk: Når separasjon spenningen er på etter eksempel injeksjon, et signal sendes fra CE-autosampler til det masse spectrometer for utløsing av datainnsamling. Separasjon gjeldende reduseres fra begynnelsen under separasjon på grunn av dynamisk pH krysset eksempel stablingsrekkefølgen. Deretter gjenoppretter gjeldende gradvis.

5. databasesøk de innsamlede Raw filer med TopPIC programvare

  1. Overføre *.Raw filer, inkludert MS og MS-/ MS data, fra en datamaskin dedikert til databasen søker masse spectrometer datamaskinen.
    Merk: Disse *.RAW filene kan være store og krever en kraftig datamaskin for å nå en rask databasesøk.
  2. Last ned ProteoWizard og TopPIC suite på datamaskinen tilegnet databasen søker.
    Merk: ProteoWizard og TopPIC er åpen kildekode programvare og kan grunnlegge online (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC suite: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt databaser brukes for databasesøk og kan finnes på UniProt nettsted.
  3. Konvertere *.Raw filer til .mzML filer med msconvert, et MS fil format konverteringsverktøy ProteoWizard28. I GUI av msconvert (MSConvertGUI.exe), klikker du Bla gjennom og velg filen *.Raw skal konverteres. Velg mzML som utdataformat og holde alle andre alternativer på standardverdiene. Klikk Start nederst til høyre på GUI.
  4. Konvertere .mzML filer til .msalign filer med verktøyet TopFD i TopPIC suite29.
    1. I GUI av TopFD (topfd_gui.exe), klikker du filen og velger filen .mzML opprettet i forrige trinn. Beholde standardverdiene for parameterne, og klikk deretter knappen Start nederst til høyre på GUI.
      Merk: TopFD konverterer forløper og fragment isotopanrikning klynger til monoisotopic massene og identifiserer mulig proteoform funksjoner i MS1 data ved å kombinere forløper isotopanrikning klynger med lignende monoisotopic massene og nær Overføringstidspunkt. Tre filer genereres fra TopFD, inkludert en ms1.msalign-fil, en ms2.msalign-fil og en .feature fil. Ms1.msalign og ms2.msalign filene inneholder deconvoluted monoisotopic masser av MS1 og MS-/ MS spektra, henholdsvis. Filen .feature inneholder mulig proteoform funksjoner.
  5. Utføre en databasesøk med TopPIC (versjon 1.1.3) i TopPIC suite30.
    1. I TopPIC GUI (toppic_gui.exe), klikk på filen og velge en passende database for å søke.
    2. Klikk på Spectrum fil og velg ms2.msalign filen genereres i trinn 5.4.1 som inndata. Merke MS1 funksjonen fil og velg .feature filen genereres i trinn 5.4.1.
    3. Angi cystein carbamidomethylation (C57) som en fast endring på grunn av IAA behandling.
      Merk: En tekstfil kan også opprettes med ulike fast modifikasjoner av en teksteditor. Deretter kan tekstfilen velges ved hjelp av knappen fil ved fast endringer i TopPIC GUI.
    4. Velg funksjonen lokkefugl databasen og under cutoff innstillinger, velg FDR (false oppdagelsen rate) i rullegardinmenyen ved siden av spekteret nivå. Angi FDR til 0,01 på spectrum nivå og 0,05 på proteoform nivå.
      Merk: TopPIC gir flere alternativer for å filtrere resultatene: spekteret nivå FDR, proteoform nivå FDR eller begge. FDR beregnes basert på mål-lokkefugl tilnærming31.
    5. La generere funksjonen deaktivert og satt feil toleranse (ppm) til 15.
    6. Under Avanserte parametere, velger du 2 for maksimalt antall masse skift i det miste-ned menyen. Angi den maksimale massen Skift (Da) ukjent modifikasjoner til 500 Da. la alle andre parametere på standardverdiene og klikk Start nederst rett på GUI.
      Merk: TopPIC programvaren genererer to resulterende tekstfilene. Filen med suffikset. OUTPUT_TABLE inneholder identifisert proteoform-spektrum kamper (PrSMs), og med et suffiks. FORM_OUTPUT_TABLE inneholder listen over identifiserte proteoforms. For hver PrSM, programvaren gir generell informasjon om kampen, observerte fragmentering mønster, matchet fragment ioner og oppdaget masse SKIFT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser et diagram over den dynamiske pH-kryss-baserte CZE-ESI-MULTIPLE Sclerosis systemet brukes i eksperimentet. En lang plugg på utvalget i en grunnleggende buffer injiseres i en LPA-belagt separasjon kapillær fylt med en sur BGE. Etter at høye spenninger vil I og II, analytter i sonen prøven være konsentrert via dynamisk pH krysset metoden. For å evaluere resultatene av CZE-MS-system, er en standard proteinet blanding (cytochrome c, lysozyme, β-kasein, myoglobin, CA og BSA) vanligvis analysert. Det representative electropherogram for standard protein blandingen er vist i figur 2A. Standard protein blandingen er vanligvis kjøre minst i duplikat evaluere separasjon effektiviteten og reproduserbarhet av systemet. Separasjon effektiviteten kan evalueres med antall teoretisk plater av noen proteiner, som vist i figur 2B. Reproduserbarhet kan bli vurdert av de relative standardavvikene av protein intensitet og overføring. Figur 3 En viser zoomet inn utsikt over en electropherogram av E. coli protein utvalget analysert av dynamisk pH-krysset-baserte CZE-MS/MS. Normalisert nivå (NL) protein intensiteten bør være på omfanget av 108 1 µg E. coli proteiner er lastet for analyse med en quadrupole ion felle masse spectrometer. Zoomet inn utsikt over electropherogram kan brukes til å vurdere vinduet separasjon av systemet. I dette tilfellet er vinduet separasjon 80-90 min. Figur 3B viser et eksempel PrSM, inkludert generell tilsvarende proteoform informasjon, protein sekvens, observerte fragmentering mønster og modifikasjoner. Svært lav E-verdien (2.11E-48) og Spectral FDR (0) høy tillit proteoform-ID. Det høye antallet matchet fragment ioner (60) ytterligere indikerer høy tillit av IDen. Observerte fragmentering mønsteret viser at fragmentering av proteoform er svært effektiv på termini og midtre delen av proteoform. N-terminal spalting av tre aminosyrer (MTM) bestemmes gjennom databasen søket.

Figure 1
Figur 1 : Diagram av dynamisk pH-krysset-baserte CZE-ESI-MULTIPLE Sclerosis systemet. Prøven er oppløst i 50 mM ammonium bikarbonat, pH 8. BGE er 5% eller 10% (v/v) eddiksyre, pH ~2.4 eller ~ 2.2. En 1-m LPA-belagt kapillær brukes for separasjon. En elektro-kinetically pumpet skjede flyt grensesnitt brukes å CZE til MS. En quadrupole ion felle masse spectrometer brukes. Høy spenning jeg (HV jeg) er levert av strømforsyningen integrert i CE-autosampler for separasjon. Høy spenning II (HV II) angis som en separat strømforsyning for electrospray. Den masse spectrometer er jordet. Avstanden mellom hullet av emitter og inngangen til det masse spectrometer er ~ 2 mm. Mellom slutten av av etset kapillær i emitter og hullet av emitter ligger mindre enn 500 µm. Hullet av electrospray emitter er 20-40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Data av en standard protein blanding analysert av dynamisk pH-krysset-baserte CZE-MS. (A) dette panelet viser en base topp electropherogram. (B) dette panelet viser antall teoretisk plater (N) tre proteiner. Eksempel injeksjon volumet var 500 nL. HV jeg var 30 kV for separasjon og HV II var 2.2 kV for electrospray. BGE var 5% (v/v) eddiksyre, pH 2.4. Utvalget var i 50 mM ammonium bikarbonat (pH 8) og inneholder cytochrome c (0,01 mg/mL), lysozyme (0,01 mg/mL), β-kasein (0.04 mg/mL), myoglobin (0,01 mg/mL), karbonsyre anhydrase (CA, 0,05 mg/mL) og storfe serum albumin (BSA, 0,1 mg/mL). Ingen MS-/ MS spectra anskaffet for standard protein blanding prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Data E.coli proteomeanalyzed av den dynamiske pH-krysset-baserte CZE-MS/MS. (A) denne panelet viser et zoomet inn visningen av basert topp electropherogram av E. coli protein prøven. (B) dette panelet viser et eksempel PrSM identifisert gjennom TopPIC databasen søket til ervervet MS-/ MS spectra. Generell tilsvarende proteoform informasjon, protein sekvens, observert fragmentering mønster, og endringene vises. De samsvarende fragment ionene fra individuelle PrSM kan også vises hvis nødvendig. HV jeg var 20 kV for separasjon og HV II var 2.2 kV for electrospray. BGE var 10% (v/v) eddiksyre, pH ~ 2.2. Utvalget var i 50 mM ammonium bikarbonat (pH 8) protein konsentrasjonen var 2 mg/mL. Eksempel injeksjon volumet var 500 nL. Top8 DDA metode ble brukt til å hente dataene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en detaljert protokoll for å bruke CZE--MS-/ MS for høyoppløselig karakterisering av proteoforms i enkle protein prøver og store identifikasjonen av proteoforms i komplekse proteom prøver. Et diagram av CZE-ESI--MS-/ MS er vist i figur 1. Det er fire avgjørende skritt i protokollen. Først er utarbeidelse av høy kvalitet LPA belegg på den indre veggen av separasjon kapillær ekstremt viktig. En LPA-belagt separasjon kapillær kan redusere EOF i av kapillær, utvide vinduet separasjon av CZE og redusere protein adsorpsjon sin indre veggen19. Polymerisasjon reaksjonen for gjør LPA belegget er utført via fylle av kapillær med en blanding av akrylamid (monomer) og ammonium persulfate (polymerisasjon initiator), etterfulgt av oppvarming av kapillær i et vannbad utløse den reaksjon22. Timingen i vannbad er avgjørende. For kort en reaksjonstid vil føre til en ufullstendig reaksjon og dårlig belegg. Vi tillater vanligvis reaksjonen til goup 50 minutter, slik at reaksjonen å fortsette i en lengre periode for en bedre belegg. Med lengre reaksjon perioder av kapillær kan bli blokkert og en såkalt HPLC pumpe måtte brukes til å presse ut polymer i kapillær med vann. En LPA-belagt kapillær benyttes kontinuerlig for om en uke, basert på litteratur data og vår erfaring22.

Andre kritiske trinn er kopling CZE til MS med elektro-kinetically pumpet skjede strømmen CE-MS grensesnitt25,26. Avstanden mellom slutten av separasjon kapillær i ESI emitter og emitter munnstykket påvirker følsomheten til CZE-MS betydelig, og en kortere avstand produserer en høyere følsomhet25. Slutten av separasjon kapillær må være etset med HF, å redusere ytre diameter fra 360 µm til mindre enn 100 µm, slik at slutten av kapillær å bli presset nær emitter munnstykket. Avstanden mellom emitter orifice og masse spectrometer inngangen er optimalisert for å nå den beste sensitivitet og god stabilitet26. Vi vanligvis holde avstanden rundt 2 mm.

Det tredje kritiske trinnet er CZE-MS og MS-/ MS analyse med dynamisk pH-krysset-baserte online prøve stabling19. PH i prøven bufferen og BGE må være betraktelig annerledes for å sikre effektiv utvalg stabling. Protein konsentrasjonen i utvalget må være riktig. Hvis protein konsentrasjonen er for høy, kan proteiner bli utløst i av kapillær under eksempel stabling. Protein konsentrasjonen av prøvene tall 2 og 3 kan betraktes som vanlige eksempler. Det siste kritiske trinnet er databasen søket med TopPIC for proteoform IDer30. Flere trinn kreves for konverteringer før databasen søket med TopPIC kan utføres. Et riktig FDR-filter er nødvendig for å sikre kvaliteten på de identifiserte proteoforms. Vi vanligvis bruker en 1% spektrum nivå FDR filtrere søkeresultatene databasen. Vi oppmerksom på at topp-ned Proteomikk initiativet er en veldig god ressurs for topp-ned Proteomikk metoder og data analyse programvare32,33.

Vi må oppmerksom på at enkelte deler av protokollen må endres litt og noen feilsøking kan være nødvendig. Tidspunktet for polymerisering i vannbad for utarbeidelse av LPA belegget kan variere på forskjellige labs. Tiden for HF etsing av separasjon kapillær må endres litt på grunn av en annen temperatur i forskjellige labs. Når CE-MS grensesnittet, kontroller at electrospray er stabilt før threading av separasjon kapillær i electrospray emitter. Hvis ingen electrospray eller en ustabil electrospray er observert, kan du kontrollere grensesnitt for å gjøre at det ikke er noen store bobler i emitter, i Teller slangen som brukes til å koble skjede buffer ampullen og T. I tillegg avstanden mellom hullet av emitter og masse spectrometer inngangen kan påvirke electrospray stabilitet og vanligvis ca 2 mm. Electrospray spenning kan også påvirke spray stabiliteten. For 20 - 40 µm emittere er 2-2.2 kV vanligvis god nok. Som beskrevet i forrige avsnitt, må protein konsentrasjonen i utvalget være riktig. Hvis protein konsentrasjonen er for høy, kan proteiner bli utløst i av kapillær under eksempel stabling. Ta hensyn til gjeldende profil på CE autosampler datamaskinen. Hvis gjeldende er null på begynnelsen av CZE kjøre, betyr det at en plugg av luft injiseres i av kapillær under eksempel injeksjon steg. Kontroller at volumet av eksemplet i ampullen er stor nok. Hvis gjeldende er normalt i begynnelsen og plutselig blir tom under kjøringen, betyr det vanligvis at protein konsentrasjonen er for høy.

CZE-MS/MS basert på denne protokollen gir høy oppløsning karakterisering av enkle protein prøver og den store ovenfra og ned Proteomikk av komplekse proteomes. Som et eksempel nærmet CZE-MS høyoppløselig karakterisering av en standard proteinet blanding som inneholder seks proteiner19. Som vist i figur 2, CZE-MS tydelig atskilt seks proteiner med høy separasjon effektivitet, avdekket tre former for β-kasein og oppdaget mange urenheter. Eksempel gitt single-shot CZE-MS/MS reproduserbar over 500 proteoform IDer og 190 protein-IDer fra E. coli proteom, med bare 1 µg E. coli proteiner med en 1% spektrum nivå FDR19. CZE-MS/MS forbedret antall proteoform-IDer fra en kompleks proteom av minst tre ganger, sammenlignet med tidligere single-shot CZE--MS-/ MS studier. Som vist i Figur 3A, nådde CZE-MS/MS samtidig et 500-nL eksempel lasting volum og en 90 minutters separasjon vindu for analyse av E. coli proteom19. TopPIC programvaren gir omfattende informasjon om de identifiserte proteoforms (Figur 3B). CZE--MS-/ MS systemet gir omfattende og høy oppløsning ovenfra og ned Proteomikk Proteomikk fellesskapet med et nyttig verktøy.

CZE--MS-/ MS har fortsatt noen begrensninger for dypt ovenfra og ned Proteomikk. Selv om vi viste at CZE-MS/MS kan nå over 500proteoform-IDer fra E. coli proteom i en enkelt, er antall proteoform IDer fra single-shot CZE-MS/MS bare ca 50% fra state-of-the-art RPLC--MS-/ MS34, 35. I denne protokollen brukes bare HCD for protein fragmentering, fører til begrenset fragmentering dekning av identifiserte proteoforms. Flere forbedringer kan gjøres i CZE--MS-/ MS protokollen å forbedre både antallet og kvaliteten på proteoform IDer fra single-shot CZE-MS/MS. Først gir øke lengden på separasjon kapillær et bredere separasjon vindu, fører til mer proteoform IDer. Andre bruker en masse spectrometer med en mye høyere løse makt, raskere skanne rente, og flere fragmentering metoder (f.eksHCD,36 elektron overføring dissosiasjon [ETD],37 og ultrafiolett photodissociation [UVPD]38 ) vil absolutt forbedre både antall proteoform IDer og fragmentering dekning av identifiserte proteoforms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Heedeok Hong gruppe ved Institutt for kjemi, Michigan State University, for vennlig å gi Escherichia coli cellene for eksperimenter. Forfatterne takker støtte fra National Institute of General Medical Sciences, den National Institutes of Health (NIH) gjennom Grant R01GM118470 (til X. Liu) og Grant R01GM125991 (til L. solen og X. Liu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

Kjemi problemet 140 ovenfra og ned Proteomikk kapillære sone geleelektroforese electrospray ionization tandem massespektrometri proteoform Escherichia coli
Store ovenfra og ned Proteomikk bruker kapillær sone geleelektroforese Tandem massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen,… More

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter