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Cancer Research

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58651
,
1Department of Translational Oncology,German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences,Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology,NCT and Heidelberg University Hospital

Summary

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

Abstract

Immunothérapie des cancers réussie a le potentiel pour obtenir un contrôle tumoral à long terme. Malgré des succès cliniques récentes, il reste un besoin urgent de traitements sûrs et efficaces adaptés aux profils immunitaire de chaque tumeur. Virus oncolytiques permettent l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que l’expression des gènes de tumeur restreints. Ce protocole décrit l’analyse de génération et ex vivo des immunomodulateurs oncolytiques vecteurs. En se concentrant sur les virus de la rougeole vaccin encodage bispécifiques lymphocytes T recruteurs à titre d’exemple, la méthodologie générale peut être adaptée à d’autres espèces de virus et de transgènes. Le flux de travail présenté comprend la conception, clonage, sauvetage et la propagation des virus recombinants. Dosages pour analyser la cinétique de la réplication et l’activité lytique du vecteur, ainsi que des fonctionnalités de l’isolé immunomodulateur ex vivo sont inclus, ce qui facilite la génération de nouveaux agents de développement dans les modèles précliniques et finalement traduction clinique.

Introduction

Virus oncolytiques (OVs) sont développés comme des thérapies de lutte contre le cancer qui spécifiquement répliquer au sein et tuer les cellules de la tumeur tout en conservant les tissus sains intacts. Il est devenu commun de comprendre cette virothérapie oncolytiques (OVT), dans la plupart des cas, ne repose pas uniquement sur la lyse tumorale complète en réplication efficace et la diffusion du virus, mais exige des mécanismes supplémentaires d’action pour la réussite du traitement, y compris vasculaire et stromales ciblage et, surtout, la stimulation immunitaire1,2,3,4. Tandis que plusieurs des premières études OV utilisé virus non modifiées, les recherches actuelles a profité d’une biologique améliorée compréhension, virus biobanques qui contiennent potentiellement roman OVs et les possibilités offertes par génie génétique afin de créer des avancées OV plates-formes5,6,7.

Vu le succès récent de l’immunothérapie, immunomodulateurs transgènes sont particulièrement intéressantes concernant le génie génétique OVs. Expression ciblée de ces produits de gène par les cellules tumorales infectées par OV réduit la toxicité par rapport à l’administration systémique. Ciblage est obtenue en utilisant des virus avec oncoselectivity inhérent ou en modifiant le tropisme viral8. Immunomodulation locale améliore les mécanismes anti-tumorale multi-facettes de OVT. En outre, cette stratégie est instrumentale dans l’interrogation de l’interaction entre les virus, les cellules tumorales et le système immunitaire. À cette fin, ce protocole prévoit un flux de travail applicable et réglable afin de concevoir, clone, sauvetage, propager et valider des vecteurs de paramyxovirus (plus précisément les virus de la rougeole) oncolytiques codant ces transgènes.

Modulation de la réponse immunitaire peut être réalisée par une grande variété de produits de transgene ciblant les différentes étapes du cancer-immunité cycle9, y compris renforcer la reconnaissance de l’antigène tumoral [par exemple, les antigènes associés aux tumeurs (AVA) ou des inducteurs de complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules] plus soutenir la maturation des cellules dendritiques pour la présentation des antigènes efficace (cytokines) ; recrutement et activation des cellules immunitaires désirés comme cytotoxiques et des cellules de helper T [chimiokines, bispécifiques recruteurs de lymphocytes T (TSEI)] ; cibler les cellules suppressives comme les lymphocytes T régulateurs, cellules myéloïdes dérivés suppressives, macrophages associées à la tumeur et cancer associés aux fibroblastes (TSEI, des anticorps, cytokines) ; et prévenir l’inhibition des cellules effectrices et épuisement (inhibiteurs de point de contrôle). Ainsi, il existe une pléthore d’agents biologiques. Évaluation de ces immunomodulateurs virus-encodé en ce qui concerne l’efficacité thérapeutique et les synergies possibles ainsi que la compréhension des mécanismes respectifs est nécessaire d’améliorer le traitement du cancer.

Virus à ARN simple brin sens négatif de la famille des Paramyxoviridae sont caractérisées par plusieurs caractéristiques propices à leur utilisation en tant que vecteurs oncolytiques. Il s’agit d’une oncotropism naturelle, grande capacité de génomique pour transgènes (plus de 5 Ko)10,11, efficace de diffusion dont la formation de syncytiums et forte immunogénicité12. Par conséquent, les plates-formes OV canine distemper virus13oreillons virus14, Newcastle disease virus15, virus Sendai16,17, Simien 518et de paramyxovirus Tupaia19 ont été développés. Plus en évidence, vivre de vaccin contre le virus rougeoleux atténué souches (MV) ont progressé dans le développement préclinique et clinique20,21. Ces souches de virus ont été utilisés pendant des décennies pour la vaccination systématique avec une excellente sécurité record22. En outre, il n’y a aucun risque pour la mutagénèse insertionnelle en raison de la réplication strictement cytosolique du paramyxovirus. Un système polyvalent de génétique inverse issu des ADNc anti-génomique qui permet l’insertion de transgènes dans unités de transcription supplémentaires (ATUs) est disponible de11,23,24. Vecteurs de MV symporteur de l’iodure de sodium (MV-NIS) d’encodage pour l’imagerie et de radiothérapie ou de l’antigène carcinoembryonnaire soluble (MV-ACE) comme marqueur de substitution pour l’expression des gènes viraux sont actuellement évalués dans des essais cliniques (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 et NCT00408590). Administration sécuritaire a été confirmée et efficacité antitumorale ont été signalés dans les précédentes études25,26,27,28,29, 30 (évaluée par Msaouel et Al.31), ouvrant la voie à des virus de la rougeole oncolytiques supplémentaires qui ont été développées et testées à l’intérêt. MV encodage immunomodulatrices molécules ciblant les diverses étapes du cycle du cancer-immunité auraient dû être divulgués de ralentir la croissance tumorale et/ou prolonger la survie chez les souris, avec la preuve de leur efficacité immunitaire et à long terme mémoire immunitaire protectrice en syngénique modèles de souris. Les transgènes vecteur codé comprennent stimulant factor (GM-CSF)32,33, H. pylori Activation des neutrophiles protéine34, point de contrôle immunitaire inhibiteurs35, des colonies de granulocytes et macrophages interleukine-12 (IL-12)36, Ava37et TSEI38, qui réticuler un antigène de surface de tumeur avec CD3 et ainsi induire une activité antitumorale par les cellules T polyclonales, quel que soit T cell receptor spécificité et co-stimulation ( La figure 1). Les résultats précliniques prometteurs obtient pour ces constructions de nouveaux efforts translationnelle demande.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), un type j’ai le virus herpès simplex encodage GM-CSF, est le seul oncolytiques thérapeutiques approuvés par l’United States Food Drug Administration (FDA) et de l’Agence européenne des médicaments (EMA). L’étude de phase III menant aux homologations en fin 2015 n’a pas seulement montré une efficacité au site d’injection intra-tumorale, mais aussi des effets abscopal (c.-à-d., les remises des lésions non injectés) dans le mélanome avancé,39. T-VEC est entré depuis lors des essais supplémentaires pour application dans d’autres entités de la tumeur (par exemple cancer de la peau non-mélanome, , NCT03458117, cancer du pancréas, NCT03086642) ainsi que l’évaluation des thérapies de combinaison, surtout avec le point de contrôle immunitaire inhibiteurs (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 et Ribas et Al.40).

Cela montre non seulement le potentiel de l’immunothérapie oncolytiques, mais aussi la nécessité de poursuivre les recherches afin d’identifier les combinaisons supérieures de OVT et l’immunomodulation. Une conception rationnelle des vecteurs supplémentaires et leur développement pour les essais précliniques est essentielle pour cette entreprise. Cela fera avancer aussi la compréhension des mécanismes sous-jacents et a des implications pour la progression vers le traitement du cancer plus personnalisée. À cette fin, cette publication présente une méthodologie pour la modification et le développement du paramyxovirus pour immunothérapie ciblée contre le cancer et, plus particulièrement du virus de la rougeole oncolytiques encodage anticorps prise avec des lymphocytes T (Figure 2).

Protocol

Remarque : [O], [P] et [M] indiquent les paragraphes applicables à : OVs en général, (la plupart) paramyxovirus ou MV, respectivement. [B] indique les sections spécifiques pour BTE transgènes. 1 clonage de transgènes codant immunomodulateur en vecteurs de Virus de la rougeole [O] conception insérez la séquence. [O] choisir un immunomodulateur d’intérêt basé sur la recherche dans la littérature ou sur exploratoire des donné…

Representative Results

La figure 1 illustre le mécanisme d’action du virus de la rougeole oncolytiques encodage bispécifiques recruteurs de lymphocytes T. Un organigramme illustrant le flux de travail de ce protocole est présenté à la Figure 2. Figure 3 illustre un exemple d’un génome de virus de la rougeole oncolytiques modifiés. Cela fournit une représentation visuelle des changements spéci…

Discussion

Oncolytique immunothérapie (i.e., OVT en combinaison avec l’immunomodulation) est très prometteur pour le traitement du cancer, exigeant davantage développement et optimisation de virus oncolytiques codant des protéines immunomodulatrices. Ce protocole décrit les méthodes pour générer et valider ces vecteurs pour contrôle ultérieur dans des modèles précliniques appropriés et potentielle future traduction clinique en nouveaux traitements contre le cancer.

Nombreuses plat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces méthodes ont été établies dans le groupe virothérapie dirigé par Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts au Centre National pour les maladies tumorales à Heidelberg. Nous sommes reconnaissants envers lui et tous les membres de l’équipe du laboratoire, en particulier le Dr Tobias Speck, le Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, les Birgit Hoyler et que les Jessica Albert. Ce travail a été soutenu par l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 à C.E. Engeland) et l’allemand National Science Foundation (DFG, accorder EN 1119/2-1 à Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel reçoit une allocation de la Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Materials

Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Life Science, Mannheim, Germany 4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot K1231
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Germany 28704
NEB 10-beta Competent E. coli New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany C3019I
LB medium after Lennox Carl Roth, Karlsruhe, Germany X964.1
Ampicillin Carl Roth, Karlsruhe, Germany HP62.1
QIAquick Miniprep Kit QIAGEN, Hilden, Germany 27104
Restriction enzyme HindIII-HF New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 31966-021
Fetal bovine serum (FBS) Biosera, Boussens, France FB-1280/500
FugeneHD Promega, Mannheim, Germany E2311 may be replaced by transfection reagent of choice
Kanamycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany K0129
Vero cells ATCC, Manassas, VA, USA CCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg available upon request
Granta-519 DSMZ, Braunschweig, Germany ACC 342
Opti-MEM (serum-free medium) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) PromoKine, Heidelberg, Germany PK-CA20-300-1000 includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns QIAGEN, Hilden, Germany 31014
Sodium chloride Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.3
Imidazole Carl Roth, Karlsruhe, Germany I5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa Merck, Darmstadt, Germany UFC901024
BCA Protein Assay Kit Merck Milipore 71285-3
IgG from human serum Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I4506
Anti-HA-PE Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-257 RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody BD Biosciences, Heidelberg, Germany 555749 RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 12158167001 RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-090-485
MS Columns Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
MiniMACS Separator Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-303
RIPA buffer Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA MB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega, Mannheim, Germany G1780 includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifter Corning, Reynosa, Mexico 3008
10 cm dishes Corning, Oneonta, NY, USA 430167
15 cm dishes Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 639160
96-well plates, U-bottom TPP, Trasadingen, Switzerland 92097
96-well plates, flat bottom Neolab, Heidelberg, Germany 353072
6-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353046
12-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353043
50 mL tubes nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany 02-572-3001
T175 cell culture flasks Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot 159910
0.22 µm filters Merck, Darmstadt, Germany SLGPM33RS
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Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (143), e58651, doi:10.3791/58651 (2019).
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