פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.
חיסוני סרטן מוצלח יש פוטנציאל להשגת שליטה הגידול לטווח ארוך. למרות ההצלחות האחרונות קליני, נותר צורך דחוף טיפולים יעילה ובטוחה המותאמים פרופילים המערכת החיסונית גידול בודדים. וירוסים Oncolytic לאפשר את תנאי הגיוס של תגובות חיסוניות אנטי הגידול, כמו גם ביטוי גנים בעל הגבלת הגידול. פרוטוקול זה מתאר את דור לשעבר vivo וניתוח של וקטורים oncolytic immunomodulatory. התמקדות וירוסים החיסון נגד חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה, המתודולוגיה הכללית ניתן להתאים וירוס מינים אחרים, transgenes. זרימת העבודה הציג כוללת של עיצוב, שיבוט, הצלה, הפצת וירוסים רקומביננטי. מבחני לנתח שכפול קינטיקה, פעילות lytic של וקטור הפונקציונליות של immunomodulator מבודדים ex-vivo כלולים, ובכך להקל על הדור של סוכנים הרומן להמשך פיתוח במודלים פרה, ובסופו של דבר תרגום רפואי.
Oncolytic וירוסים (OVs) מפותחים כמו הרפוי אנטי סרטניים, במיוחד לשכפל בתוך ולהרוג תאים סרטניים תוך השארת רקמות בריאה ללא פגע. זה הפך נפוץ להבין את virotherapy oncolytic (ש’), ברוב המקרים, לא להסתמך רק על פירוק הגידול מלאה על-ידי שכפול יעיל והפצת של הוירוס, אבל דורש מנגנון פעולה נוספים להצלחה בטיפול, כולל כלי הדם, סטרומה מיקוד ומעל הכל גירוי המערכת החיסונית1,2,3,4. בעוד מחקרים רבים OV מוקדם בשימוש וירוסים שלא שונתה, המחקר הנוכחי יש שהרוויח ביולוגית משופרת הבנה, וירוס biobanks המכילים פוטנציאל הרומן OVs, ואת האפשרויות המוצעות על ידי הנדסה גנטית על מנת ליצור OV מתקדם פלטפורמות5,6,7.
לאור ההצלחה האחרונה של חיסוני, immunomodulatory transgenes הם עניין מיוחד בנושא הנדסה גנטית של OVs. ביטוי יישוב של המוצרים בהם הגן על-ידי תאי הגידול הנגועים OV מפחית רעילות לעומת ניהול מערכתי. פילוח מושגת באמצעות וירוסים עם oncoselectivity הגלום או על-ידי שינוי נגיפי tropism8. Immunomodulation המקומיות משפר את מנגנוני אנטי הגידול ומגובש של עבודה בשעות נוספות. יתר על כן, אסטרטגיה זו הוא אינסטרומנטלי חוקר את יחסי הגומלין בין וירוסים, תאים סרטניים את מערכת החיסון של הפונדקאי. לשם כך, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה ישימים, הניתנים לשינוי עיצוב, שיבוט, להציל, להפיץ של אמת oncolytic paramyxovirus (במיוחד וירוס חצבת) וקטורים קידוד כזה transgenes.
אפנון של התגובה החיסונית יכולה להיות מושגת על ידי מגוון רחב של מוצרים transgene מיקוד שלבים שונים של סרטן-חסינות מחזור9, כולל שיפור זיהוי אנטיגן הגידול [למשל, אנטיגנים סרטניים הקשורים (תעש) או inducers של מרכזי histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות] מעל תמיכה תא דנדריטי ההבשלה למצגת יעילה אנטיגן (ציטוקינים); גיוס והפעלת תאים חיסוניים הרצוי כגון ציטוטוקסיות helper T תאי [נוגדנים, bispecific תא T engagers (BTEs)]; פילוח מדכא תאים כגון בתאי T רגולטוריים, התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול, מקרופאגים סרטניים הקשורים לסרטן-הקשורים fibroblasts (נוגדנים, BTEs, ציטוקינים); ומניעת עיכוב תא אפקטור ותשישות (מעכבי המחסום). לפיכך, שפע של גורמים ביולוגיים זמין. הערכה של כזה immunomodulators מקודד וירוס לגבי היעילות הטיפולית ואת הסינרגיה אפשרי, כמו גם ההבנה של מנגנונים בהתאמה יש צורך לשפר טיפול בסרטן.
וירוסי RNA חד-גדילי תחושה שלילית של משפחת Paramyxoviridae מאופיינים על ידי תורמת את השימוש בהם מספר תכונות כמו oncolytic וקטורים. אלה כוללים oncotropism טבעי, קיבולת גנומית transgenes (יותר מ 5 kb)10,11, היעילה מתפשט כולל היווצרות syncytia ו- immunogenicity גבוהה12. לכן, פלטפורמות OV בהתבסס על וירוס כלבלבת13, וירוס חזרת14, וירוס מחלת ניוקאסל15,16,סנדאי וירוס17, וירוס קופיים 518, Tupaia paramyxovirus19 פותחו. בולטת, חיים חיסון וירוס חצבת הקלוש זנים (MV) התקדמו קליניות פיתוח20,21. זני וירוס אלה שימשו במשך עשרות שנים עבור חיסונים שגרתיים עם שיא בטיחות מעולה22. יתר על כן, אין שום סיכון עבור insertional מוטגנזה מכוונת בשל השכפול בקפדנות cytosolic של paramyxoviruses. מערכת רב תכליתי גנטיקה הפוכה המבוססת על אנטי-גנומית cDNA המאפשר החדרת transgenes ליחידות שעתוק נוספים (ATUs) הוא זמין11,23,24. וקטורים MV קידוד symporter סודיום יודיד (MV-ש”ח) לדימות, הקרנות או אנטיגן carcinoembryonic מסיסים (MV-CEA) כסמן הפונדקאית על ביטוי גנים ויראליים הם שמחושב כעת בניסויים קליניים (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ו- NCT00408590). ניהול בטוח אושרה, דווח על מקרים של יעילות אנטי הגידול הקודם מחקרים25,26,27,28,29, 30 (נבדקה על ידי Msaouel et al.31), לסלול את הדרך עבור וירוסים חצבת oncolytic נוספים יש פותחה, נבדק preclinically. MV קידוד immunomodulatory מולקולות מיקוד שלבים מגוונים של מחזור סרטן-חסינות הוכחו לעכב צמיחת הגידול ו/או להאריך את הישרדות בעכברים, עם הוכחה יעילות החיסון בתיווך, זיכרון לטווח ארוך של מערכת החיסון מגן ב- syngeneic מודלים העכבר. מקודד וקטור transgenes כוללים המושבה גרנולוציט-מקרופאג מגרה פקטור (GM-CSF)32,33, חלבון מפעיל נויטרופילים של ה פילורי 34, מעכבי המערכת החיסונית מחסום35, אינטרלוקין-12 (IL-12)36תעש37, BTEs38, אשר קשר צולב אנטיגן פני שטח הגידול עם CD3, ובכך לעודד פעילות אנטי הגידול על-ידי תאי T polyclonal, ללא קשר (ירידה לפרטים וגירוי שיתוף של קולטן תא T איור 1). תוצאות פרה מבטיח שהושג בונה דרישה נוספת translational למאמצים אלו.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), סוג אני וירוס הרפס סימפלקס קידוד GM-CSF, הוא oncolytic היחידה הטיפולית אושרה על ידי ארצות הברית מזון, והתרופות האמריקני (FDA) סוכנות התרופות האירופית (EMA). שלב המחקר השלישי המוביל אישורי בשנת 2015 מאוחר לא רק הראו יעילות באתר של הזרקת אינטרה-tumoral, אלא גם השפעות abscopal (קרי, הפוגות של נגעים ללא הזרקת) במלנומה מתקדמת39. T-VEC מאז נכנסה ניסויים נוספים עבור יישומים אחרים הישויות הגידול (למשל סרטן עור שאינו מלנומה, , NCT03458117; סרטן הלבלב, NCT03086642), הערכה של טיפולים משולבים, במיוחד עם מחסום המערכת החיסונית מעכבי (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ו Ribas et al.40).
זה מדגים לא רק את הפוטנציאל של חיסוני oncolytic, אלא גם את הצורך בהמשך מחקר לזיהוי סופריור שילובים של תעריף שעות נוספות, immunomodulation. עיצוב רציונלית של וקטורים נוספים ופיתוח שלהם לבדיקה פרה הוא המפתח במשימה. זה גם לקדם את ההבנה של מנגנונים הבסיסית, יש השלכות על ההתקדמות לקראת טיפול בסרטן אישית יותר. לשם כך, פרסום זה מציג את המתודולוגיה שינוי ופיתוח של paramyxoviruses על חיסוני סרטן ממוקד, ליתר דיוק, של וירוסי חצבת oncolytic קידוד נוגדנים מפעיל את תא T (איור 2).
Oncolytic חיסוני (כלומר., שעות נוספות בשילוב עם immunomodulation) טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפול בסרטן, בדרישה נוספת פיתוח ואופטימיזציה של וירוסים oncolytic קידוד חלבונים immunomodulatory. פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי ליצור ולאמת כזה וקטורים עבור בדיקות עוקבות הרלוונטיים במודלים פרה, תרגום קליניים עתידיים פוטנ…
The authors have nothing to disclose.
שיטות אלה הוקמו בקבוצה Virotherapy בראשות פרופסור ד ר ד ר גיא Ungerechts במרכז הלאומי למחלות הגידול בהיידלברג. . אנחנו חבים לו ואת כל חברי צוות מעבדה, במיוחד ד ר טוביאס שפק, ד ר Rūta Veinalde, ג’ודית פורסטר, בירגיט Hoyler ו ג’סיקה אלברט. עבודה זו נתמכה על ידי עוד Kröner-Fresenius-Stiftung (גרנט 2015_A78 כדי Engeland לספירה) של קרן המדע הלאומית הגרמנית (DFG, להעניק EN 1119/2-1 לספירה Engeland). J.P.W. Heidbuechel מקבל מלגה על ידי הלמהולץ הבינלאומי המדרשה לחקר הסרטן.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |