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Cancer Research

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58651
,
1Department of Translational Oncology,German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences,Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology,NCT and Heidelberg University Hospital

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Abstract

Erfolgreich den Krebs-Immuntherapie hat das Potenzial, langfristige Tumorkontrolle zu erreichen. Trotz der jüngsten klinischen Erfolge bleibt ein dringender Bedarf an sicheren und wirksamen Therapien auf individuellen Tumor immun Profile zugeschnitten. Onkolytische Viren ermöglichen die Induktion von Anti-Tumor-Immunantwort sowie Tumor beschränkt Genexpression. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Ex Vivo-Analyse der immunmodulatorische onkolytische Vektoren. Fokussierung auf Masern-Impfstoff Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel, kann die allgemeine Methodik zu anderen Virus-Arten und transgene angepasst werden. Die dargestellte Workflow umfasst Design, Klonen, Rettung und Verbreitung von rekombinanten Viren. Assays zur Replikation Kinetik und lytische Aktivität des Vektors sowie Funktionalität des isolierten Immunmodulator ex Vivo Analyse enthalten sind, und erleichtert so die Generation der neuen Agenten für die weitere Entwicklung in präklinischen Modellen und letztlich klinische Übersetzung.

Introduction

Onkolytische Viren (OVs) entstehen als Anti-Krebs-Therapeutika, die speziell in replizieren und Tumorzellen zu töten, wobei gesundes Gewebe intakt bleibt. Es ist mittlerweile gemeinsamen Verständnis, dass onkolytische Virotherapie (OVT), in den meisten Fällen, verlässt sich nicht allein auf komplette Tumor-lyse durch effiziente Replikation und die Verbreitung des Virus, aber erfordert zusätzlichen Wirkmechanismen Behandlungserfolg, einschließlich vaskuläre und Stromazellen targeting und allem Immunstimulation1,2,3,4. Während viele OV Frühstudium unveränderte Viren verwendet, hat aktueller Forschung profitiert eine verbesserte biologische Verständnis, Virus Biobanken, die potenziell Roman OVs und die Möglichkeiten der Gentechnik um erweiterte OV schaffen enthalten Plattformen5,6,7.

Angesichts der jüngsten Erfolge der Immuntherapie, sind immunmodulatorische transgene von besonderem Interesse bezüglich der Gentechnik OVs. Gezielte Ausdruck solcher gen-Produkte von OV-infizierte Tumorzellen reduziert die Toxizität im Vergleich zu systemischen Verabreichung. Targeting wird mithilfe von Viren mit inhärenten Oncoselectivity oder durch Ändern der viralen Tropismus8erreicht. Lokalen Immunmodulation verbessert die facettenreichen anti-Tumor-Mechanismen der OVT. Darüber hinaus ist diese Strategie maßgeblich daran beteiligt das Zusammenspiel zwischen Viren, Tumorzellen und dem Immunsystem des Wirts zu verhören. Dieses Protokoll sieht zu diesem Zweck einen anwendbar und einstellbaren Workflow zu gestalten, Klonen, zu retten, zu propagieren und validieren onkolytische Paramyxovirus (speziell Masernvirus) Vektoren Codierung solche transgene.

Modulation der Immunantwort kann durch eine Vielzahl von Transgen-Produkten, die auf verschiedenen Stufen der Krebs-Immunität Zyklus9, einschließlich der Verbesserung der Tumor Antigen Anerkennung [z. B. Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) oder Induktoren der erreicht werden großen Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle] über Unterstützung von dendritischen Zellen Reifung für effizienten Antigenpräsentation (Zytokine); Rekrutierung und Aktivierung gewünschte Immunzellen wie zytotoxische und T-Helfer-Zellen [Chemokine, bispezifische T Zelle Engagers (HdOs)]; Ausrichtung auf unterdrückerische Zellen wie regulatorische T-Zellen, myeloische abgeleitet Suppressor-Zellen und Tumor-assoziierten Makrophagen Krebs-assoziierten Fibroblasten (Antikörper, BTEs, Zytokine); und Vermeidung von Effektor Zellen Hemmung und Erschöpfung (Checkpoint-Hemmer). So gibt es eine Fülle von biologischen Arbeitsstoffen. Bewertung von solchen Virus-codierte Immunmodulatoren zur therapeutischen Wirksamkeit und mögliche Synergien sowie Verständnis der jeweiligen Mechanismen ist notwendig, Verbesserung der Krebstherapie.

Negativen Sinne einzelsträngigen RNA-Viren der Familie Paramyxoviridae zeichnen sich durch mehrere Merkmale förderlich für ihre Verwendung als onkolytische Vektoren. Dazu gehören ein natürliches Oncotropism, große genomische Kapazität für transgene (mehr als 5 kb)10,11, effiziente Verbreitung einschließlich Syncytia Bildung und hohe Immunogenität12. Daher OV-Plattformen basierend auf Hundestaupe Virus13, Mumps-Virus14, Newcastle Disease Virus15, Sendai-Virus16,17, simian Virus 518und Modellorganismus Paramyxovirus19 entstanden sind. Vor allem live abgeschwächten Masern-Virus-Impfstoff, die Stämme (MV) in präklinischen und klinischen Entwicklung20,21vorangekommen sind. Diese Virusstämme wurden jahrzehntelang für Routineimpfungen mit einen ausgezeichneten Sicherheit Aufzeichnung22verwendet. Darüber hinaus gibt es kein Risiko für insertional Mutagenese durch die streng cytosolischen Replikation von Paramyxoviruses. Ein vielseitiges reverse Genetik-System basierend auf Anti-genomische cDNA ermöglicht eine Einfügung von transgenen in zusätzliche Transkriptionseinheiten (ATUs) ist verfügbar11,23,24. MV-Vektoren Codierung Natrium-Iodid-Symporter (MV-NIS) für Bildgebung und Strahlentherapie oder lösliche carcinoembryonales Antigen (MV-CEA) als ein Surrogat-Marker für virale Genexpression werden derzeit in klinischen Studien (NCT02962167, NCT02068794, geprüft NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 und NCT00408590). Sichere Verwaltung bestätigt wurde und der Anti-Tumor-Wirkung wurden Fälle in früheren Studien25,26,27,28,29, 30 (rezensiert von Msaouel et al.31), ebnet den Weg für zusätzliche onkolytische Masern-Viren, die entwickelt wurden und preclinically getestet. MV Codierung immunmodulatorische, die Moleküle gezielt verschiedene Schritte des Krebs-Immunität Zyklus gezeigt worden, um Tumorwachstum verzögern und/oder verlängert Überleben bei Mäusen, mit Nachweis für immun-vermittelte Wirksamkeit und schützende immun Langzeitgedächtnis im Phänomen Maus-Modellen. Vektor-codierte transgene gehören Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF)32,33, H. Pylori Neutrophilen-aktivierende Protein34, immun Checkpoint-Hemmer35 Interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37und BTEs38, die ein Tumor Oberflächenantigen mit CD3 zu vernetzen und so induzieren anti-Tumor-Aktivität von polyklonalen T-Zellen, unabhängig von der T-Zell-Rezeptor Spezifität und Co-Stimulation ( ( Abbildung 1). Die vielversprechende präklinische Ergebnisse für diese Konstrukte weitere translational Anstrengungen bedarf.

Talimogene Laherparepvec (T-VEC), eine Art ich Codierung GM-CSF, Herpes-Simplex-Virus ist die einzige onkolytische therapeutische genehmigt durch die United States Food und Drug Administration (FDA) und European Medicines Agency (EMA). Die Phase-III-Studie führt zu Genehmigungen Ende 2015 hat nicht nur Wirksamkeit auf dem Gelände des Intra-Tumor Injektion, aber auch Abscopal Effekte (z.B. Remissionen nicht injiziert Läsionen) in fortgeschrittenem Melanom39gezeigt. T-VEC getreten da zusätzliche Prüfungen für die Anwendung in anderen Tumorentitäten (z.B., nicht-Melanom-Hautkrebs, NCT03458117, Bauchspeicheldrüsenkrebs, NCT03086642) sowie eine Bewertung der Kombinationstherapien, vor allem mit immun-checkpoint Inhibitoren (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 und Ribas et al.40).

Dies zeigt nicht nur das Potential der onkolytische Immuntherapie, sondern auch die weiteren Forschungsbedarf, hervorragende Kombinationen von OVT und Immunmodulation zu identifizieren. Rationales Design von zusätzlichen Vektoren und ihre Entwicklung zur präklinischen Prüfung ist der Schlüssel zu diesem Unternehmen. Dies wird auch Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen voraus und hat Auswirkungen auf die Entwicklung hin zu stärker personalisierten Krebstherapie. Zu diesem Zweck präsentiert dieser Publikation die Methodik für die Modifikation und Entwicklung von Paramyxoviruses für gezielte Krebsimmuntherapie und genauer gesagt, der onkolytische Masern-Viren Codierung T-Zell-Gewinnung Antikörper (Abbildung 2).

Protocol

Hinweis: [O], [P] und [M] Unterabschnitte für anzugeben: OVs im Allgemeinen, (die meisten) Paramyxoviruses oder MV nur, beziehungsweise. [B] zeigt Abschnitte speziell für BTE transgene. 1 Klonen von transgenen Immunmodulator Codierung in Masern-Virus-Vektoren [O] Design einfügen Sequenz. [O] entscheiden Sie sich für ein Immunmodulator Interesse basierend auf Literaturrecherchen oder explorative Daten wie genetische Bildschirme<sup clas…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Wirkmechanismus von onkolytische Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers. Ein Flussdiagramm Darstellung des Workflows dieses Protokolls wird in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines modifizierten onkolytische Masern-Virus Genoms. Dies bietet eine visuelle Darstellung der spezifischen Änderungen auf die Masern Virus Anti-Gen…

Discussion

Onkolytische Immuntherapie (dh., OVT in Kombination mit Immunmodulation) hält große Verheißung für die Krebsbehandlung, anspruchsvolle weitere Entwicklung und Optimierung von onkolytische Viren immunmodulatorische Proteine codieren. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum generieren und validieren diese Vektoren für die spätere Prüfung in relevanten präklinischen Modellen und potenzielle zukünftige klinische Übersetzung in neuer Anti-Krebs-Therapeutika.

Zahlreiche verschied…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Methoden wurden in der Virotherapie Gruppe unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts im nationalen Zentrum für Tumorerkrankungen in Heidelberg gegründet. Wir sind verpflichtet, ihm und allen Mitgliedern des Labor-Teams, vor allem Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler und Jessica Albert. Diese Arbeit wurde von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung unterstützt (Grant 2015_A78, C.E. Engeland) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, C.E. Engeland EN 1119/2-1 gewähren). J.P.W. Heidbuechel erhält ein Stipendium in Höhe von Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Materials

Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Life Science, Mannheim, Germany 4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot K1231
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Germany 28704
NEB 10-beta Competent E. coli New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany C3019I
LB medium after Lennox Carl Roth, Karlsruhe, Germany X964.1
Ampicillin Carl Roth, Karlsruhe, Germany HP62.1
QIAquick Miniprep Kit QIAGEN, Hilden, Germany 27104
Restriction enzyme HindIII-HF New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 31966-021
Fetal bovine serum (FBS) Biosera, Boussens, France FB-1280/500
FugeneHD Promega, Mannheim, Germany E2311 may be replaced by transfection reagent of choice
Kanamycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany K0129
Vero cells ATCC, Manassas, VA, USA CCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg available upon request
Granta-519 DSMZ, Braunschweig, Germany ACC 342
Opti-MEM (serum-free medium) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) PromoKine, Heidelberg, Germany PK-CA20-300-1000 includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns QIAGEN, Hilden, Germany 31014
Sodium chloride Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.3
Imidazole Carl Roth, Karlsruhe, Germany I5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa Merck, Darmstadt, Germany UFC901024
BCA Protein Assay Kit Merck Milipore 71285-3
IgG from human serum Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I4506
Anti-HA-PE Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-257 RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody BD Biosciences, Heidelberg, Germany 555749 RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 12158167001 RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-090-485
MS Columns Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
MiniMACS Separator Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-303
RIPA buffer Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA MB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega, Mannheim, Germany G1780 includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifter Corning, Reynosa, Mexico 3008
10 cm dishes Corning, Oneonta, NY, USA 430167
15 cm dishes Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 639160
96-well plates, U-bottom TPP, Trasadingen, Switzerland 92097
96-well plates, flat bottom Neolab, Heidelberg, Germany 353072
6-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353046
12-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353043
50 mL tubes nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany 02-572-3001
T175 cell culture flasks Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot 159910
0.22 µm filters Merck, Darmstadt, Germany SLGPM33RS
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Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (143), e58651, doi:10.3791/58651 (2019).
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