Ved hjælp af robotsystemer til at behandle og integrere Colon Murine prøver for histologiske analyser
Summary
Mangel på standardisering for murine væv behandling mindsker kvaliteten af murine histopatologiske analyse i forhold til humant prøvemateriale. Vi præsenterer her, en protokol for at udføre histopatologisk undersøgelse af murine betændte og uninflamed Colon væv vise gennemførligheden af robotsystemer rutinemæssigt anvendes til forarbejdning og indlejring menneskelige prøver.
Abstract
Forståelse for menneskelige sygdomme er blevet stærkt udvidet takket være studiet af dyremodeller. Ikke desto mindre skal histopatologisk vurdering af eksperimentelle modeller være så strenge som der er ansøgt om menneskelige prøver. Faktisk, pålidelige og præcise konklusioner er kritisk påvirket af kvaliteten af væv afsnittet forberedelse. Her, beskriver vi en protokol for histopatologiske analyse af murine væv, der implementerer flere automatiserede trin under proceduren, fra den indledende forberedelse til paraffin indlejring af murine prøverne. Reduktion af metodologiske variabler gennem streng protokol standardisering fra automatiserede procedurer bidrager til øget samlede pålidelighed af murine patologiske analyse. Specifikt, denne protokol beskriver udnyttelse af edb-behandling og indlejring robotsystemer, rutinemæssigt anvendes til forarbejdning af væv og paraffin indlejring af menneskelige prøver for at behandle murine modeller af tarmbetændelse. Vi konkludere, at pålideligheden af histopatologisk undersøgelse af murine væv er steget betydeligt efter indførelsen af standardiserede og automatiserede teknikker.
Introduction
I de sidste årtier, er blevet udviklet flere eksperimentelle modeller for at dissekere de patogene mekanismer, der fører til menneskelige sygdomme1,2. For at vurdere sværhedsgraden af en sygdom, forskere vurderer effekten af en behandling og studere de cytologiske og histologiske arkitektoniske variationer eller mængden af betændelse3. Hvis du vil udføre på disse eksperimentelle modeller, er detaljerede histopatologiske analyser nødvendige, ofte sammenligne murine og menneskelige prøver4,5.
Derudover menneskelige prøver er almindeligt behandles og scoret af histopatologi core faciliteter og erfarne menneskelige patologer gennem standardiseret histopatologiske kriterier og metoder. Omvendt, murine væv er normalt fast, integreret og analyseres af forskere med begrænset erfaring med histopatologiske protokoller. Kvaliteten og pålideligheden af histopatologiske undersøgelse begynder med forberedelsen af høj kvalitet væv sektioner. Flere faktorer bidrage kritisk til at øge eller mindske kvaliteten af den endelige analyse, herunder fiksering, makroskopiske skæring, behandling, paraffin indlejring, og indlejring af prøver6,7.
Alle disse passager, der involverer manipulation af prøven er udsat til manuel fejl, herunder manuelle indlejring af prøverne og i mindre grad, manuel mikrotomen skæring og farvning. På nuværende tidspunkt bygger hele processen med murine væv forberedelse til histologisk vurdering på protokoller, der varierer fra laboratorium til laboratorium og manuel protokoller. Målet med denne undersøgelse er at gennemføre standardiseret automatiseret protokoller for at reducere fejl og variabilitet i murine histopatologiske undersøgelse.
Til vores viden beskriver vi her de første protokoller for fuldautomatisk væv forarbejdning og indlejring til histologisk vurdering af murine væv; disse bruges rutinemæssigt i patologi enheder til analyser af humant prøvemateriale. Som et praktisk eksempel på mulighederne for metoden, en murine model af tarmbetændelse er blevet analyseret, dvs, modellens kronisk colitis forårsaget af gentagen indgift af dextran natriumsulfat (DSS) i drikkevand8 ,9. Denne eksperimentelle indstilling nøje ligner menneskelige inflammatoriske tarm sygdomme (IBD)10 da DSS-behandlede dyr udviser tegn på tarmbetændelse, fx vægttab, løs afføring eller diarré, og afkortning af colon samt fibrose 8,9,11. Som observeret for menneskelige IBD patienter, genererer DSS behandling en kompleks sygdomsforløb. I forbindelse skal udarbejde histologiske evalueringer forstå den dybtgående ændring af væv arkitektur. Således implementeringen af de beskrevne protokoller for at øge prøve præparationskvalitet kan gavne forskere bygger på fortolkning af histologiske og immunhistokemisk analyse for murine eksperimentelle indstillinger. Murine eksperimentelle modeller af menneskelige sygdomme der involverer ændringer af væv arkitektur, tilstedeværelsen af cellevæv infiltrere eller betændelse i forskellige væv og organer (tarmen, hjerne, lever, hud) kunne bruge øget kvaliteten af den prøveforberedelse til histopatologisk undersøgelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi anvender forskellige automatiserede trin under forberedelse af murine væv til histopatologisk analyse. Denne protokol sigter mod at levere teknisk hints til at øge reproducerbarhed og standardisering af hele processen, hvilket vil øge den overordnede kvalitet af de histopatologiske slutevaluering. Vi implementeret automatiske instrumenter og metoder til udarbejdelse og indlejring af væv, rutinemæssigt anvendes i patologi core faciliteter for studiet af humant prøvemateriale.
For at vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Institut for patologi af IRCCS Policlinico Hospital, Milano for teknisk support og IEO dyr facilitet for bistand i husdyrhold.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
