Met behulp van Robotic systemen te verwerken en Embed Colon lymfkliertest monsters voor histologisch Analyses
Summary
Gebrek aan standaardisatie voor lymfkliertest bewerking vermindert de kwaliteit van lymfkliertest histopathologisch analyse ten opzichte van menselijke specimens. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van histopathologisch onderzoek van lymfkliertest ontstoken en uninflamed Colon weefsels te tonen van de haalbaarheid van robotic systemen routinematig gebruikt voor het verwerken en menselijke specimens te embedding.
Abstract
Het begrip van ziekten bij de mens is zeer uitgebreid dankzij de studie van diermodellen. Histopathologisch evaluatie van experimentele modellen moet echter zo streng zijn als die toegepast voor menselijke specimens. Inderdaad, betrouwbare en nauwkeurige conclusies te trekken is kritisch beïnvloed door de kwaliteit van het weefsel sectie voorbereiding. Hier beschrijven we een protocol voor histopathologisch analyse van lymfkliertest weefsels die verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de procedure, vanaf de eerste voorbereiding implementeert tot de paraffine inbedding van de lymfkliertest monsters. De vermindering van de methodologische variabelen door middel van strenge protocol standaardisatie van geautomatiseerde procedures draagt bij tot meer algemene betrouwbaarheid van lymfkliertest pathologische analyse. In het bijzonder dit protocol beschrijft het gebruik van geautomatiseerde verwerking en insluiten Robotsystemen, routinematig gebruikt voor de verwerking van het weefsel en paraffine inbedding van menselijke specimens, voor het verwerken van lymfkliertest specimens van darmontstekingen. We concluderen dat de betrouwbaarheid van het histopathologisch onderzoek van lymfkliertest weefsels aanzienlijk is verhoogd bij invoering van gestandaardiseerde en geautomatiseerde technieken.
Introduction
In de afgelopen decennia zijn verschillende experimentele modellen ontwikkeld om te ontleden de pathogene mechanismen die leiden tot ziekten bij de mens1,2. Om te beoordelen van de ernst van een ziekte, moeten onderzoekers evalueren het effect van een behandeling en bestuderen de cytologische en histologische architecturale variaties of het bedrag van ontsteking3. Wilt uitvoeren op deze experimentele modellen, zijn gedetailleerde histopathologische analyses nodig, vaak vergelijken lymfkliertest en menselijke monsters4,5.
Bovendien, menselijke specimens worden meestal verwerkt en scoorde door histopathologie kern faciliteiten en ervaren menselijke pathologen via gestandaardiseerd histopathologisch criteria en methoden. Omgekeerd, lymfkliertest weefsels zijn meestal vaste, ingesloten en geanalyseerd door onderzoekers met weinig ervaring van histopathologische protocollen. De kwaliteit en betrouwbaarheid van histopathologisch onderzoek begint met de voorbereiding van hoogwaardige weefselsecties. Verschillende factoren bijdragen kritisch tot de verhoging of verlaging van de kwaliteit van de uiteindelijke analyse, met inbegrip van fixatie, macroscopische afdelen, verwerking, paraffine insluiten, en inbedding van de monsters6,7.
Alle deze passages met betrekking tot manipulatie van het monster zijn onderworpen aan handmatige fouten, met inbegrip van handmatige inbedding van de monsters en, in mindere mate, handmatige microtoom segmenteren en kleuring. Op dit moment berust het hele proces van lymfkliertest weefsel voorbereiding voor histologisch evaluatie op protocollen die van laboratorium tot laboratorium variëren en handmatige protocollen. Het doel van deze studie is om gestandaardiseerde geautomatiseerde protocollen om fouten en variabiliteit in lymfkliertest histopathologisch onderzoek te verminderen.
Om onze kennis beschrijven we hier de eerste protocollen voor volledig geautomatiseerde weefsel verwerking en insluiten voor de histologische evaluatie van lymfkliertest weefsels; deze worden routinematig gebruikt in pathologie eenheden voor de analyses van menselijke specimens. Een praktisch voorbeeld van de haalbaarheid van de methode, een lymfkliertest model van darmontstekingen heeft zijn geanalyseerd, dat wil zeggen, de chronische colitis model veroorzaakt door herhaalde toediening van dextran natriumsulfaat (DSS) in het drinkwater8 ,9. Deze experimentele instelling nauw lijkt op menselijke ontstoken darm ziekten (IBD)10 aangezien DSS-behandelde dieren tekenen van darmontstekingen, bijvoorbeeld gewichtsverlies, losse ontlasting of diarree en verkorting van de dikke darm, alsmede fibrose vertonen 8,9,11. Zoals opgemerkt voor menselijke IBD patiënten, DSS behandeling genereert een complexe ziekte-cursus. In dit verband, uitgebreide histologische evaluaties dienen te begrijpen van de ingrijpende wijziging van de architectuur van het weefsel. Dus, de uitvoering van de beschreven protocollen voor het verhogen van de sample voorbereiding kwaliteit zouden kunnen profiteren van onderzoekers afhankelijk van de interpretatie van histologische en immunohistochemische analyseert voor lymfkliertest experimentele instellingen. Lymfkliertest experimentele modellen van ziekten bij de mens met betrekking tot wijzigingen van de architectuur van weefsel, de aanwezigheid van cellulaire weefsel infiltreren of ontsteking in verschillende weefsels en organen (darm, lever, hersenen, huid) kon gebruiken de betere kwaliteit van de bereiding van de monsters voor histopathologisch onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij gebruiken verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de bereiding van lymfkliertest weefsels histopathologische analyseren. Dit protocol heeft tot doel technische tips om de reproduceerbaarheid en de standaardisatie van het hele proces, dus de verbetering van de algehele kwaliteit van de eindevaluatie histopathologisch te verhogen. Wij geautomatiseerde instrumenten en methoden voor de voorbereiding en de inbedding van weefsels, routinematig gebruikt in pathologie kern voorzieningen voor de studie van menselijke s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de afdeling pathologie van het ziekenhuis IRCCS Policlinico, Milaan voor technische ondersteuning en de OIE dier faciliteit voor bijstand in de veehouderij.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
