באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית
Summary
היעדר סטנדרטיזציה לעיבוד רקמות מאתר מפחית את האיכות של ניתוח histopathological מאתר לעומת דגימות אנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע בדיקה histopathological מאתר מודלק, uninflamed הגס רקמות כדי להראות את הכדאיות של מערכות רובוטיות בשימוש שגרתי עבור עיבוד והטבעה דגימות אנושי.
Abstract
ההבנה של מחלות האדם הורחבה במידה רבה בזכות המחקר בבעלי חיים כמודלים. למרות זאת, הערכת histopathological ניסיוניות צריך להיות קפדני ביותר כמו להחיל עבור דגימות אנושי. אכן, הסקת מסקנות אמין ומדויק באופן ביקורתי מושפעת האיכות של רקמות סעיף הכנה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לניתוח histopathological של רקמות מאתר המיישמת מספר פעולות אוטומטיות במהלך ההליך, משלב הכנת הראשונית ועד פרפין הדגימות מאתר. ההפחתה של משתני מתודולוגי באמצעות פרוטוקול קפדני סטנדרטיזציה של שגרות אוטומטיות תורמת האמינות הכוללת של מאתר ניתוח פתולוגי. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר את הניצול של עיבוד ממוכן, הטמעת מערכות רובוטיות, בשימוש שגרתי עבור עיבוד רקמות ופרפין הטבעה של דגימות אנושי, לעבד מאתר דגימות של דלקת מעיים. . נסיים המהימנות של histopathological בחינת רקמות מאתר זה גדל באופן משמעותי עם הקדמה של טכניקות מתוקננת ואוטומטיים.
Introduction
בעשרות השנים האחרונות, פותחו מספר גרסאות ניסיוניות לנתח את המנגנונים פתוגניים שמוביל מחלות אנושיות1,2. כדי להעריך את חומרת המחלה, החוקרים חייבים להעריך את ההשפעה של טיפול וללמוד את הווריאציות אדריכלי cytological, היסטולוגית או הסכום של דלקת3. כדי לבצע על אלה גרסאות ניסיוניות, ניתוח histopathological מפורט נדרשים, לעיתים קרובות השוואה בין דגימות מאתר האנושי4,5.
בנוסף, דגימות האנושית בדרך כלל מעובדים שבוים על ידי מתקני histopathology, מנוסה פתולוגים האנושית דרך סטנדרטית ושיטות histopathological. לעומת זאת, רקמות מאתר בדרך כלל קבוע, מוטבע, נותחו על ידי החוקרים עם ניסיון מוגבל של פרוטוקולים histopathological. האיכות והאמינות של בדיקה histopathological מתחיל עם הכנת קטעי רקמה באיכות גבוהה. מספר גורמים תורמים באופן ביקורתי הגדל או הקטן האיכות של הניתוח הסופי, כולל קיבוע, מאקרוסקופית חלוקתה, עיבוד, שעוות פרפין הטבעה, והטבעה של דגימות6,7.
כל הקטעים מעורבים מניפולציה של המדגם נחשפים שגיאות, כולל שיבוץ ידני של הדגימות ובמידה פחותה יותר, ידני מיקרוטום חלוקתה, מכתים. כיום, התהליך כולו של רקמות מאתר לקראת הערכה היסטולוגית מסתמך על פרוטוקולים של משתנים מעבדה מעבדה ופרוטוקולים ידנית. מטרת מחקר זה היא ליישם מתוקננת פרוטוקולים אוטומטיים כדי להפחית שגיאות ולשינויים בבדיקה histopathological מאתר.
לידע שלנו, נתאר כאן את הפרוטוקולים הראשון בשביל לרקמות אוטומטית לחלוטין עיבוד והטבעה על הערכה היסטולוגית של רקמות מאתר; אלה משמשים באופן שגרתי ביחידות פתולוגיה עבור הבדיקות דגימות תאים של בני. דוגמה מעשית של הכדאיות של השיטה, מודל מאתר של דלקת מעיים נותחה, קרי, המודל קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של לתוספי סודיום סולפט (DSS) מי השתייה8 ,9. ההגדרה ניסיוני מקרוב דומה האדם מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלות10 מאז שטופלו DSS בעלי חיים מגלים סימנים של דלקת מעיים, למשל, ירידה במשקל, צואה רופף או שלשול ו לקיצור של המעי הגס, כמו גם פיברוזיס 89,,11. כפי שנצפו בחולים אנושיים מחלת המעי הדלקתי, טיפול DSS יוצר קורס מחלה מורכבת. בהקשר זה, הערכות היסטולוגית משוכלל נדרשים להבין את שינוי מעמיק של הארכיטקטורה רקמות. לכן, היישום של הפרוטוקולים שתואר להגברת איכות הכנה מדגם יועיל חוקרים להסתמך על הפרשנות של היסטולוגית וניתוחים immunohistochemical עבור הגדרות ניסיוני מאתר. מאתר ניסיוניות של מחלות האדם המערבים שינויים של האדריכלות רקמות, הנוכחות של רקמת הסלולר לחדור או דלקת ברקמות שונות ואיברים (המעי, המוח, הכבד, העור) יכול להשתמש איכות מוגברת הכנת הדוגמא לבדיקה histopathological.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מנצלים את השלבים אוטומטיות שונות במהלך ההכנות של רקמות מאתר ניתוח histopathologic. פרוטוקול זה מכוון לספק רמזים טכני כדי להגדיל את הפארמצבטית ותקינה של התהליך כולו, ובכך שיפור האיכות הכוללת של הערכת histopathological הסופי. אנחנו ליישם כלים אוטומטיים ושיטות ההכנה והטבעה של רקמות, בשימוש שגרתי פתולוג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המחלקה לפתולוגיה של החולים פוליקליניקו (policlinico) IRCCS, מילאנו לתמיכה טכנית, המתקן חיה IEO לסיוע בגידול בעלי חיים.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
