로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함
Summary
Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.
Abstract
인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.
Introduction
마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.
또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처리, 파라핀, 포함 및 샘플6,7의 포함에 기여.
샘플의 조작 관련 된 이러한 모든 구절 수동 샘플의 포함을 포함 하 여 수동 오류 및 낮은 범위, 단면 및 얼룩 수동 톰 대상이 됩니다. 현재, 조직학 평가 murine 조직 준비의 모든 과정은 다양 한 연구소에서 실험실 프로토콜 및 수동 프로토콜 의존 합니다. 이 연구의 목표 오류와 murine histopathological 시험에 다양성을 줄이기 위해 표준화 자동화 프로토콜을 구현 하는 것입니다.
우리의 지식, 여기 완전 자동된 조직 처리 및 murine 조직;의 조직학 평가 대 한 포함에 대 한 첫 번째 프로토콜 설명 이러한 인간의 표본 분석에 대 한 병 리 단위에서 정기적으로 사용 됩니다. 방법의 타당성의 실용적인 예를 들어, 창 자 염증의 murine 모델 분석 된, 즉, , 만성 대 장 염 모델으로 인 한 식 수8 에서에서 dextran 나트륨 황산 염 (DSS)의 반복된 관리 9. DSS 처리 동물 예를 들면, 체중 감소, 느슨한 대변 또는 설사, 및 섬유 증 뿐만 아니라 콜론의 단축 창 자 염증의 표시를 전시 하기 때문에 인간의 선 동적인 장 질병 (IBD)10 유사한 밀접 하 게이 실험 설정 8,,911. 인간의 IBD 환자에 대 한 관찰, DSS 처리는 복잡 한 질병 과정을 생성 합니다. 이러한 맥락에서 정교한 조직학 평가 조직 아키텍처의 심오한 변화를 이해 해야 합니다. 따라서, 샘플 준비 품질을 높이기 위한 기술된 프로토콜의 구현 조직학의 해석에 의존 하는 연구자를 유익할 수 있습니다 고 immunohistochemical murine 실험 설정에 대 한 분석. 조직 구조의 변경에 관련 된 인간 질병의 murine 실험 모델, 세포 조직 침투 또는 다른 조직 및 장기 (내장, 뇌, 간, 피부)에 염증의 존재의 증가 품질 사용할 수 있는 histopathological 검사를 위한 샘플 준비입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.
이 방법의 잠재적인 적?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
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