Med hjälp av robotsystem att bearbeta och bädda in kolon murina prover för histologiska analyser
Summary
Brist på standardisering för murina vävnad behandling minskar kvaliteten på murina histopatologisk analys jämfört med mänskliga prover. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra histopatologisk undersökning av murina inflammerad och uninflamed colonic vävnader att Visa genomförbarheten av robotsystem som rutinmässigt används för bearbetning och inbäddning mänskliga prover.
Abstract
Förståelsen av mänskliga sjukdomar har kraftigt utökats tack vare studien av djurmodeller. Histopatologisk bedömning av experimentella modeller behöver dock vara lika rigorös som tillämpas för mänskliga prover. Tillförlitliga och korrekta slutsatser påverkas faktiskt kritiskt av kvaliteten på vävnaden avsnittet förberedelser. Här beskriver vi ett protokoll för histopatologisk analys av murina vävnader som implementerar flera automatiserade steg under förfarandet, från inledande förberedelserna till för paraffin inbäddning av murina proverna. Minskning av metodologiska variabler genom rigorösa protokoll standardisering från automatiserade procedurer bidrar till ökad övergripande tillförlitlighet av murina patologiska analys. Bestämt detta protokoll beskriver användningen av automatiserad behandling och inbäddning robotsystem, rutinmässigt används för vävnad behandling och paraffin inbäddning av mänskliga prover, för att bearbeta murina exemplar av tarminflammation. Vi dra slutsatsen att tillförlitligheten av histopatologisk undersökning av murina vävnader ökas betydligt vid införandet av standardiserade och automatiserade tekniker.
Introduction
I de sista årtiondena, har flera experimentella modeller utvecklats för att dissekera de patogena mekanismerna leder till mänskliga sjukdomar1,2. För att bedöma svårighetsgraden av en sjukdom, måste forskarna utvärdera effekten av en behandling och studera de cytologiska och histologiska arkitektoniska variationerna eller mängden inflammation3. Om du vill utföra dessa experimentella modeller, behövs detaljerade histopatologiska analyser ofta jämföra murina och mänskliga prover4,5.
Dessutom mänskliga prover vanligen behandlas och poängsätts av histopatologi corefaciliteter och erfarna mänskliga patologer genom standardiserade histopatologiska kriterier och metoder. Murina vävnader är däremot oftast fast, inbäddade och analyseras av forskare med begränsad erfarenhet av histopatologiska protokoll. Kvaliteten och tillförlitligheten av histopatologiska undersökningen börjar med utarbetandet av högkvalitativa vävnadssnitt. Flera faktorer bidrar kritiskt till öka eller minska kvaliteten på den slutliga analysen, inklusive fixering, makroskopiska snittning, bearbetning, paraffin inbäddning och inbäddning av prover6,7.
Alla dessa passager som involverar manipulering av provet utsätts för manuella fel, inklusive manuell inbäddning av proverna och, i mindre utsträckning, manuell mikrotomen snittning och färgning. För närvarande bygger hela processen av murina vävnad förberedelse för Histologisk undersökning på att variera från laboratorium till laboratorium och manuell protokoll. Målet med denna studie är att genomföra automatiserade standardprotokoll för att minska fel och variabilitet i murina histopatologisk undersökning.
Till vår kunskap beskriver vi här de första protokollen för helautomatiska vävnad behandling och inbäddning för histologisk utvärdering av murina vävnader; dessa används rutinmässigt i patologi enheter för analyser av mänskliga prover. Som ett praktiskt exempel genomförbarheten av metoden har en murin modell av tarminflammation analyserats, dvs, kronisk kolit modellen orsakas av upprepad administrering av dextran natriumsulfat (DSS) i dricksvatten8 ,9. Denna experimentella inställning nära liknar mänskliga inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) sjukdomar10 eftersom DSS-behandlade djur uppvisar tecken på tarminflammation, t.ex., viktminskning, lös avföring eller diarré och förkortning av den kolon samt fibros 8,9,11. Som observerats för mänskliga IBD patienter, genererar DSS behandling en komplex sjukdom kurs. I detta sammanhang krävs genomarbetade histologiska utvärderingar att förstå djupgående förändring av vävnad arkitekturen. Således, genomförandet av de beskrivna protokoll för att öka prov förberedelse kvalitet kan gynna forskare förlitar sig på tolkningen av histologiska och immunhistokemiska analyser för murina experimentella inställningarna. Murina experimentella modeller av mänskliga sjukdomar som involverar förändringar av vävnad arkitektur, förekomsten av cellvävnad infiltrera eller inflammation i olika vävnader och organ (tarmen, hjärnan, levern, huden) kunde använda den ökade kvaliteten på den provberedning för histopatologisk undersökning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi använder olika automatiserade steg under utarbetandet av murina vävnader för histopatologisk analys. Detta protokoll syftar till att ge tekniska tips för att öka reproducerbarhet och standardisering av hela processen, vilket ökar den övergripande kvaliteten på den slutliga histopatologiska utvärderingen. Vi genomfört automatiserade instrument och metoder för beredning och inbäddning av vävnader, rutinmässigt används i patologi corefaciliteter för studiet av mänskliga prover.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Institutionen för patologi IRCCS Policlinico sjukhuset, Milano för teknisk support och IEO djur anläggningen för bistånd i djurhållning.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
