Nerv-Stammzell-Differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem Plasma Behandlung In-vitro-
Summary
Dieses Protokoll soll detaillierte experimentelle Schritte von einer kalten atmosphärischen Plasmabehandlung auf neurale Stammzellen und Immunfluoreszenz-Erkennung für Differenzierung Verbesserung zu geben.
Abstract
Da die Entwicklung der physischen Plasmatechnologie, kalte atmosphärische Plasmen (CAPs) in Dekontamination, Krebsbehandlung, Wundheilung, Wurzelbehandlung, etc.weit untersucht wurden, bilden ein neues Forschungsgebiet benannt Plasmamedizin. Als eine Mischung aus elektrischen, chemischen und biologischen reaktiven Spezies, Kappen haben gezeigt, ihre Fähigkeiten, Nerv Stammzellen Differenzierung zu verbessern sowohl in Vitro und in Vivo und sind immer ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von neurologischen Krankheiten in der Zukunft. Die viel spannende Nachricht ist, dass CAPs einstufige erkennen können und sicher geleitet, Differenzierung von neuronalen Stammzellen (NSCs) für den Transport der Gewebe. Wir zeigen hier die detaillierte experimentelle Protokoll mit einem selbstgebauten CAP Jet-Gerät um zu NSC Differenzierung in C17.2-NSCs und primäre Ratte neuronalen Stammzellen zu verbessern sowie Beobachtung durch das Schicksal der Zelle invertiert und Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Färbung Technologie wir fanden beide die NSCs Differential beschleunigt als die unbehandelte Gruppe zeigte, und ~ 75 % von den NSCs differenziert selektiv in Neuronen, die vor allem ältere, cholinerge und motor Neuronen.
Introduction
Die gezielte Differenzierung von NSCs in einer bestimmten Linie für den Transport der Gewebe gilt als einer der vielversprechendsten Therapien für Neurodegenerative und Neurotraumatic Krankheiten1. Zum Beispiel sind Catecholaminergic dopaminergen Neuronen vor allem in der Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD) erwünscht. Traditionelle Methoden, um die gewünschten Zellen für den Transport vorzubereiten haben jedoch viele Nachteile, wie chemische Toxizität, Narbenbildung oder andere, die vor allem die Anwendungen der NSCs in regenerative Medizin2behindert. Daher ist es sehr notwendig, um eine neue und sichere Methode für NSC Differenzierung zu finden.
Plasma ist der vierte Zustand der Angelegenheiten, folgende Feststoff, Flüssigkeit und Gas und stellt mehr als 95 % der Fragen im ganzen Universum. Plasma ist elektrisch neutral mit ungebundenen positiven/negativen und neutralen Teilchen und wird in der Regel durch eine Hochspannungs-Entladung im Labor erzeugt. In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Anwendung von Plasma in der Biomedizin als die Entwicklung der kalten Atmosphärendruck-Plasma-Technologie weltweit große Aufmerksamkeit erregt. Dank dieser Technik stabiles Niedrigtemperatur-Plasma in der umgebenden Luft in der Atmosphäre ohne Bogen Bildung erzeugt werden kann und besteht aus verschiedenen reaktiven Spezies, wie reaktive Stickstoff-Spezies (RNS), reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Ultraviolett (UV) Strahlung, Elektronen, Ionen und elektrisches Feld3. Kappen haben einzigartige Vorteile für Mikroorganismen-Inaktivierung, Krebstherapie, Wundheilung, Behandlung von Hautkrankheiten, Zellproliferation und Zelle Differenzierung4,5,6,7. In früheren Arbeiten haben wir bewiesen, dass kalte atmosphärischem Plasma Jet die Differenzierung der NSCs in murinen neurale Stammzellen C17.2 (C17.2-NSCs) und primäre Ratte neuronalen Stammzellen verbessern kann Aussteller ein großes Potenzial zu einem mächtigen Werkzeug für die Regie Differenzierung von NSCs8. Obwohl der Mechanismus der CAP-Verbesserung der NSC Differenzierung noch nicht vollständig verstanden ist durch Kappen können keine erwies sich ein entscheidender Faktor in diesem Prozess sein. In dieser Arbeit wollen wir ein detailliertes experimentelle Protokoll mit einem Helium/Sauerstoff Atmosphärendruckplasma Jet für die Behandlung von NSCs in Vitro, Handy Vorbereitung und Vorbehandlung, Morphologie Beobachtung von inversen Mikroskop und Fluoreszenz-Mikroskopie Beobachtung der Immunfluoreszenz-Färbung.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSCs ist eine Art verewigt neurale Stammzellen Linie von Neugeborenen Mauszellen zerebelläre Körnerschicht, entwickelt von Snyder u.a.10,11. C17.2-NSCs können in Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten und sind weit verbreitet in Neurowissenschaften12. In unseren früheren Studie konnte CAPs die Differenzierung des C17.2-NSCs in Neuronen verbessern. Eine Proof of Principle Studie wurde auch durchgeführt mit primären Ratte NSCs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Huazhong Scholar Program, dem unabhängigen Innovationsfonds der Huazhong University of Science und Technology (Nr. 2018KFYYXJJ071) und die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31501099 und 51707012) unterstützt.
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
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