Summary

신경 줄기 세포 분화는 원스텝 차가운 대기 플라즈마 치료에서 체 외에 의해

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

이 프로토콜 신경 줄기 세포 및 분화 향상을 위한 면역 형광 검출에 차가운 대기 플라즈마 처리의 자세한 실험 단계를 제공 하는 것을 목표로.

Abstract

으로 실제 플라즈마 기술, 차가운 대기 플라즈마 (모자) 개발 오염, 암 치료, 상처 치유, 루트 운하 치료, 에서 널리 조사 되어, 플라즈마 의학 이라는 새로운 연구 분야를 형성. 전기, 화학, 및 생물학적 반응 종의 혼합물 이기 때문에, 모자 나타났습니다 신경 줄기 세포 분화를 향상 시키기 위해 그들의 능력 둘 다 생체 외에서 vivo와 는 신경 질환 치료를 위한 유망한 방법 고 미래. 훨씬 더 흥미로운 뉴스 이며 그 모자를 사용 하 여 한 단계, 깨닫지 안전 감독, 신경 줄기 세포 (NSCs)의 조직 교통. 여기 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSC 차별화를 강화 하는 성가 모자 제트 장치를 사용 하 여 뿐 아니라 셀 운명으로 거꾸로 관찰 하 고 형광 현미경 검사 법의 자세한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 면역 형광 검사 기술 얼룩의 도움으로 우리 모두는 NSCs 치료 그룹 보다 가속된 차동 속도 보였다 발견 하 고는 NSCs의 ~ 75%는 주로 성숙 하 고 해, 모터 신경에 선택적으로 분화 신경입니다.

Introduction

조직 교통에 대 한 특정 계보에 NSCs의 감독된 분화 신경 및 neurotraumatic 질병1에 대 한 가장 유망한 요법 중 하나 간주 됩니다. 예를 들어 catecholaminergic dopaminergic 신경 세포는 특히 파 킨 슨 병 (PD) 치료에 원하는 됩니다. 그러나, 교통에 대 한 원하는 세포를 준비 하는 전통적인 방법 화학 독성, 흉터 형성, 또는 다른 사람, 재생 의학2NSCs의 애플 리 케이 션을 크게 저해 하는 등 많은 단점이 있다. 따라서, 그것은 매우 NSC 차별화에 대 한 소설과 안전한 방법의 찾을 필요가 있다.

플라즈마 문제, 다음 고체, 액체, 가스의 제 4 상태 이며, 그것은 구성 하는 전체 우주에서 문제의 95% 이상. 플라즈마 전기 중립 중립 입자와 언바운드 긍정적/부정적 이며 일반적으로 실험실에서 고압 방전에 의해 생성 됩니다. 지난 2 년간에 의학에서 플라즈마의 응용 프로그램 차가운 대기압 플라즈마 기술 개발으로 세계적으로 큰 관심을 모으고 있다. 이 기술 덕분에 안정적인 저온 플라즈마 아크 형성 없이 분위기에 주위 공기에 생성 될 수 있습니다 및 종의 다양 한 반응, 반응 질소 종 (RNS), 반응성 산소 종 (선생님), 자외선 (UV)로 구성 되어 방사선, 전자, 이온, 및 전기 분야3. 모자는 마이크로-유기 체 비활성화, 암 치료, 상처 치유, 피부 질환, 세포 증식, 세포 감 별 법4,5,,67의 치료에 대 한 독특한 장점이 있다. 이전 작품에서는, 우리가 보여주는 차가운 대기 플라즈마 제트 murine 신경 줄기 세포 C17.2 (C17.2-NSCs)에 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSCs의 분화를 향상 시킬 수 있습니다는 감독에 대 한 강력한 도구가 될 큰 잠재력을 전시 NSCs8분화 NSC 차별화의 모자 향상의 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다 아직, 비록 모자에 의해 생성 된 NO는 과정에서 핵심 요소가 될 것 입증 되었다. 이 작품에서는, 우리는 NSCs 생체 외에서셀 준비 및 전처리, 거꾸로 한 현미경으로 형태학 관찰의 치료는 대기압 헬륨/산소 플라즈마 제트를 사용 하 여 자세한 실험 프로토콜을 제공을 목표로 하 고 면역 형광 염색 법의 형광 현미경 관찰입니다.

Protocol

1. 세포 문화 및 Predifferentiation 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation Coverslips 폴 리 D lysine 코팅을 준비 합니다. 12-잘 접시에 메 마른 coverslip (지름 20 mm)을 넣어. 다음 단계에 따라 더 나은 세포 접착에 있는 coverslips에 대 한 물 (재료의 테이블)에 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 커버 유리를 코트.참고: 최적의 조건 각 셀 라인 및 응용 프로그램에 대 한 결정 해야…

Representative Results

셀 형태 모자 치료 후 매일 거꾸로 현미경 관찰 되었다. 그림 2 는 두 셀 라인에서 세포 분화의 일반 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 이미지를 보여준다. 플라즈마 처리 그룹 가속된 분화 속도 및 제어 및 가스 흐름 그룹에 비해 높은 차별화 비율을 전시 한다. Immunofluorescent 결과 C17.2 NSCs 및 기?…

Discussion

C17.2-NSCs 일종 이다 신생아 마우스 소 뇌 세분화 된 계층 셀에서 불멸 하 게 신경 줄기 세포 선의10,11스나이더 및 다른 사람에 의해 개발. C17.2-NSCs 신경, 이다, 그리고 oligodendrocytes로 분화 할 수 있다 하 고 신경 과학12에서 널리 이용 된다. 우리의 이전 연구에서 모자 뉴런으로 C17.2 NSCs의 차별화를 향상 시킬 수 있습니다. 증거의 원리 연구…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 소 학자 프로그램, Huazhong 대학의 과학 및 기술 (No. 2018KFYYXJJ071), 그리고 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 31501099와 51707012)의 독립적인 혁신 기금에 의해 지원 되었다.

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

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Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

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