建立过度表达 dr3 的细胞系, 评估抗有丝分裂治疗的凋亡反应
Summary
建立一个稳定的细胞系, 过度表达一个有兴趣的基因, 研究基因功能, 可以通过稳定的转化后, 选择单一克隆通过逆转录病毒感染后。在这里, 我们表明, ht29-dr3 细胞系产生这种方式阐明的机制, 死亡受体 3 (dr3) 有助于抗肿瘤诱导的细胞凋亡。
Abstract
研究感兴趣的基因的功能可以通过操纵其表达水平来实现, 比如通过击倒细胞系降低其表达, 或者通过过度表达细胞系增加其表达。瞬态转染和稳定转染是外源基因表达常用的两种方法。瞬态转染只对短期表达有用, 而稳定转染则允许外源基因整合到宿主细胞基因组中, 在那里它将被连续表达。因此, 稳定转染通常被用于长期遗传调控的研究。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 以产生一个稳定的细胞系过度表达标记死亡受体 3 (dr3), 以探索 dr3 功能。我们在抗逆转录病毒感染后选择单克隆, 以保持稳定细胞系的同质性和纯度。使用该协议生成的稳定细胞系使 dr3 缺乏的 ht29 细胞对抗炎药物敏感, 从而重组 ht29 细胞的凋亡反应。此外, dr3 上的 flag 标记补偿了良好 dr3 抗体的不足, 并促进了抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子机制的生化研究。
Introduction
异源基因表达经常被用来研究感兴趣的基因的功能。在细胞和分子生物学中, 有两种方法, 即瞬态转染和稳定转染, 将一段 dna 或 rna 插入宿主细胞1,2。短暂转染的 dna 或 rna 不能传递给子细胞, 因此基因改变只能保留很短的时间。另一方面, 在稳定转染的细胞中, 外源基因被整合到宿主细胞基因组中, 维持其在细胞系中的表达。因此, 稳定转染是一种通常保留用于长期遗传调控研究的方法。稳定的细胞系也可以作为异种移植移植到小鼠模型中进行体内研究3。稳定转染可分为两类: 病毒转染和非病毒转染。与非病毒转染相比, 病毒感染可以将基因转移到更广泛的人类细胞中, 效率更高的是4、5、6、7。此外, 来自单个克隆的稳定细胞系具有均匀性和克隆纯度的优势。
不受控制的细胞生长和分裂是癌症最显著的特征。在临床环境中, 抗肿瘤药物是许多类型肿瘤的主要治疗方法8。然而, 抗肿瘤药物的一些重大限制不容忽视。首先, 这些化疗也会杀死正常细胞和不想要的癌细胞, 从而导致严重的副作用 8.其次, 抗管蛋白药物并不能有效对抗所有类型的肿瘤, 尽管管蛋白在各种不同的组织中无处不在, 作为细胞骨架蛋白9,10.目前尚不清楚为什么抗管蛋白药物在临床治疗中对卵巢癌、肺癌和血癌表现出很有希望的疗效, 但在肾癌、结肠癌或胰腺癌中却没有。最后, 即使是同类型肿瘤患者, 对抗肿瘤药物的反应也会有所不同, 无法预测。可能有一个关键的效应分子, 影响不同患者对抗肿瘤药物的敏感性, 导致在临床治疗中看到的各种结果12。因此, 应考虑患者对抗肿瘤治疗的潜在差异敏感性, 以优化治疗干预13。
高通量全基因组 sirna 文库屏幕表明, dr3 击倒可使敏感细胞对抗肿瘤药物产生耐药性, 并暗示 dr3 在化疗诱导的细胞凋亡中的作用14。作为肿瘤坏死因子受体 (tnfr) 超家族的成员, dr3 已被报道在不同系统中介导细胞凋亡15、16、17、18.因此, 我们着手建立稳定的细胞系过度表达 dr3, 研究分子机制, 其中抗肿瘤药物诱导细胞凋亡。人类结肠癌细胞线 ht29 可以提供一个合适的细胞模型来研究 dr3 过度表达, 该细胞系被发现缺乏 dr3。此外, 在诊所, 结肠癌对抗炎药物不敏感 19.
在本文中, 我们描述了一种方法, 允许产生 ht29-dr3 稳定的细胞系通过逆转录病毒感染。我们进一步展示了如何使用西方印迹验证这些细胞中的 dr3 表达, 以及如何通过使用细胞活力分析和形态学观察来评估对抗结核药物的敏感性。细胞从单个克隆体中被扩增, 因此具有均匀遗传背景的优势。此外, dr3 上的 flag 标签允许通过显微镜对细胞 dr3 进行可视化, 并通过生化方法分析基因表达和蛋白质相互作用。此外, 这些细胞可以在小鼠体内进行异种移植, 以进一步分析肿瘤的进展, 以应对体内14的抗肿瘤药物。
这里介绍的 ht29-dr3 细胞系统为研究抗肿瘤药物如何杀死癌细胞的分子机制提供了一个有效的工具。由于过度表达和击倒细胞系是研究基因功能的常用工具, 该协议可以很容易地适应其他感兴趣的基因或其他细胞系, 从而转化为一种广泛使用的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇手稿中, 我们描述了一种方法, 以生成 ht29-dr3 稳定的细胞系。ht29-dr3 细胞为研究 dr3 促进抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡的分子机制提供了一个模型。这种方法是通用和可重复的。为确保该程序的成功, 需要考虑议定书的四个关键步骤。首先, 为了产生足够高的病毒滴度, 建议在 plat-a 细胞达到 80%-90% 汇合时进行 dna 转染。其次, 病毒悬浮液应在4°c 下储存不超过 2周, 从光线下覆盖。第三, 当将受感?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了清华大学 531000117 (致 g. w.) 和 043222019 (至 x. w.) 赠款的支持。
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
