抗有糸分裂治療に対するアポトーシス応答を評価するために DR3 を過剰発現細胞株の確立
Summary
遺伝子機能の研究に興味の遺伝子を過剰発現安定細胞株を確立することは、株それらを介してレトロ ウイルス感染後安定したトランスフェクション ピッキング単一クローンによって行うことができます。この方法で生成される DR3 HT29 細胞が死受容体 3 (DR3) antimitotics によるアポトーシス誘導に貢献機構を解明を紹介します。
Abstract
興味の遺伝子の機能を勉強しては、ノックダウン細胞発現の減少や過剰発現細胞で発現を増加などの表現のレベルを操作することによって実現できます。過渡と安定したトランスフェクションは、外因性の遺伝子発現のため頻繁に使用される 2 つの方法です。トランスフェクションは、安定したトランスフェクションにより宿主細胞のゲノムに統合される外因性の遺伝子、継続的に表現されるに対しにのみ短期的な表現に便利です。その結果、安定したトランスフェクションは長期の遺伝的調節に研究のため通常用いられます。ここでタグ死受容体 3 DR3 関数を探索する (DR3) を過剰発現安定したセルラインを生成するための単純なプロトコルについて述べる。均質性と安定したセルラインの純度を維持するためにレトロ ウイルス感染後単一クローンを選んだ。このプロトコルを使用して生成された安定したセルラインはこうして HT29 細胞におけるアポトーシス応答を再構成すること、抗がん剤の薬剤に敏感な DR3 欠損 HT29 細胞をレンダリングします。また、DR3 にフラグの札良い DR3 抗体の可用性の損失を補償し、体のエージェントは、アポトーシスを誘導する分子機構の生化学的研究を促進します。
Introduction
異種遺伝子発現されている興味のある遺伝子の機能を勉強する.2 つの方法、過渡と安定したトランスフェクション海抜ホスト セル1,2に DNA または RNA のセグメントを挿入する細胞および分子生物学で使用されます。一過性トランスフェクション DNA または RNA 渡すことができない娘細胞、遺伝子は短い期間だけ保持ことができますように。その一方で、固定して transfected セルで外因性の遺伝子は細胞株での発現を維持ホスト細胞のゲノムに統合されます。したがって、安定したトランスフェクションは、長期の遺伝的調節に関する研究の通常予約されている方法です。生体内でのマウス ・ モデルに異種移植片の研究3として、安定したセルラインを移植もことができます。安定したトランスフェクションは、2 つのカテゴリに分けることができます: ウイルスや nonviral。Nonviral 遺伝子導入と比較して、ウイルス感染は、幅広い高効率4,5,6,7で人間の細胞に遺伝子を転送できます。さらに、単一のクローンから安定したセルラインは均質性とクローンの純度の利点を提供しています。
抑制されない細胞の成長と分裂は、がんの最も顕著な特徴です。臨床設定では、体のエージェントは、腫瘍8の多くの種類のための主要な治療をします。しかし、体のエージェントのいくつかの重要な制限は無視できません。まず、これらの化学療法は望ましくないがん細胞とともに正常な細胞も殺すことができるし、したがって、ことが、重篤な副作用8で。第二に、医学: 抗チューブリンの薬はチューブリンのいたるところにある細胞骨格タンパク質9,10としてさまざまな異なったティッシュの表現にもかかわらず、腫瘍のすべてのタイプに対して有効ではありません。医学: 抗チューブリン エージェントに対して有望な効果を示したが理由は不明である卵巣、肺、血液癌臨床治療ではなく、腎臓、大腸、または膵癌11。最後に、同じ種類の腫瘍でも患者に応答できます、antimitotics 異なる予測不可能な方法で。キー エフェクター分子の臨床12に見られる多様な成果の結果、体のエージェントに別の患者の感受性に影響を与える可能性があります。したがって、治療13を最適化するために考慮患者を抗がん剤治療の潜在的な差動感度を撮影する必要があります。
高スループット全体ゲノム siRNA ライブラリ画面を示した DR3 ノックダウンが敏感な細胞における化学療法誘発アポトーシス14DR3 の役割を測定、抗がん剤の薬剤に対して抵抗力をレンダリング可能性があります。腫瘍壊死因子受容体 (TNFR) スーパーファミリーのメンバーとして様々 なシステム15,16,17,18細胞のアポトーシスを仲介する DR3 を報告されています。したがって、我々 は、抗がん剤の薬剤はアポトーシスを誘導する分子機構を研究する DR3 を過剰発現する安定したセルラインを確立に着手します。DR3 の過剰発現を研究するための適切な細胞モデルは、ひと大腸癌細胞株 HT29 DR3 欠損をすることが分かったによって提供することができます。さらに、クリニックで大腸癌は敏感体薬19。
この記事ではレトロ ウイルス感染による HT29 DR3 安定したセルラインを生成を可能にする手法について述べる.さらに西部にしみが付くことを使用してこれらのセルの DR3 式を検証する方法、およびセル実行可能性の試金と形態学的観察を用いた体剤への感受性を評価する方法を示します。セルは単一のクローンから増幅され、したがって、均質な遺伝的背景の利点があります。また、DR3 にフラグ タグを生化学的アプローチによる顕微鏡と遺伝子発現および蛋白質の相互作用の解析から細胞 DR3 の可視化のため使用。さらに、セルは異種マウス体内antimitotics14の応答で腫瘍の進行をさらに分析できます。
DR3 HT29 細胞システムは、どのように antimitotics を殺す癌細胞14の分子機構を研究するための効果的なツールを提供しました。過剰発現とノックダウン細胞は遺伝子の機能を研究するための一般的なツールであるのでこのプロトコル興味やその他の細胞の他の遺伝子にも容易に適合でき、したがって、広く使用されたアプローチと化した。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、HT29 DR3 安定したセルラインを生成する手法について述べる。DR3 HT29 細胞は、DR3 が体のエージェントによって誘導されるアポトーシスに貢献する分子機構を研究するためのモデルを提供します。このアプローチは、汎用性と再現性です。プロシージャの成功を確保するためプロトコルの 4 つのステップを考慮する必要があります。まず、高を生成するために十分なウイルスの力価は…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、(ギニアビサウ) に 53110000117 と清華大学から (X.W.) に 043222019 の補助金によって支えられました。
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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