זיהוי ליגנד מחייב תחום פעילות Dimerization אלפא קולטן אסטרוגן באמצעות וזמינותו שני-היברידית יונקים
Summary
אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.
Abstract
אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. הרצף של חלבון ERα מאוד כולו בין המינים. זה כבר חשבה כי תפקידו של האדם והעכבר ERαs הוא זהה. נדגים את ההשפעה דיפרנציאלית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) על ERα ליגנד מחייב תחום (LBD) dimerization פעילות אנושית שימוש בתרבית של שני-היברידית (M2H) וזמינותו של עכבר. וזמינותו M2H יכולים להדגים את היעילות של פעילות של homodimerization LBD בתרבית של תאים, ניצול של תקנים של חלבון שני ביטוי פלסמידים (דנ א GAL4 מחייב תחום [DBD] פיוז’ן LBD ו- VP16 transactivation תחום [VP16AD] פיוז’ן LBD) ו- a אלמנט מגיב GAL4 (GAL4RE) התמזגו לוציפראז כתב פלסמיד. כאשר GAL4DBD פיוז’ן LBD ופיוז’ן VP16AD LBD להפוך דיימר בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז דרך הפעילות תלויה שעתוק VP16AD. הפעלת לוציפראז בתיווך 4OHT הוא גבוה יותר בתאים HepG2 היו transfected עם העכבר ERα LBD פיוז’ן חלבון ביטוי פלסמידים יותר בתאים אנושיים ERα LBD פיוז’ן חלבון ביטוי פלסמיד transfected. תוצאה זו עולה כי יעילותם של העכבר 4OHT תלויי-ERα LBD homodimerization פעילות הוא גבוה יותר מאשר LBD ERα האנושית. באופן כללי, הניצול של וזמינותו M2H אינה אידיאלית עבור הערכת קולטן גרעיני LBD dimerization פעילות, כי היתה ללא-חת ליגנדים לשפר את רמת הבסיס של הפעילות LBD ופוגע זה הגילוי של פעילות dimerization LBD. . מצאנו שאת 4OHT אינו משפר פעילות הבזליים ERα LBD. זה גורם מפתח עבור היכולת לקבוע ולגלות את הפעילות dimerization LBD תלויי-4OHT לשימוש בהצלחה את הבדיקה M2H. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (למשל, 4OHT) בסוגים שונים בתרבית של תאים.
Introduction
אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. Sequenceof חומצת אמינו ERα מאוד כולו בין המינים. בגלל הומולוגיה גבוה יותר בין בני האדם ואת העכבר ERα, הפונקציה של רצפטורים אלו נחשב כזהה ולאחר הפעילות דיפרנציאלית של חומרים אסטרוגניים (למשל, טמוקסיפן) של מינים אלו נגרמת על ידי ההבדלים המינים שיטות ההזנה כימי ולא על-ידי ההבדלים המבניים של ERα. ERα יש מאוד והתפאורה במבנים תחום נפוצה בקרב superfamily גרעיני קולטן (ע נ), איזור A לתחומים F. התחום E או תחום מחייב ליגנד (LBD) כוללת את הכיס ליגנד מחייב והפונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק 2, בשם AF-2. תחום F הוא מקומי ומייד בסמוך לקבוצת המחשבים E, הוא תחום משתנה ביותר בקרב NRs. גם בין האדם העכבר ERα, הומולוגיה של התחום F היא נמוכה באופן משמעותי מזו של שאר התחומים1. LBD ERα של ליגנד מכורך מגביר את homodimerization של החלבון ERα לאגד שהרכיב הספציפי DNA מגיב אסטרוגן ישירות לוויסות שעתוק גנים תלויי-ליגנד (פעולה קלאסי של ERα). מחקרים לחקר הגבישים גילו מיקום דיפרנציאלית של סליל 12 (AF-2 המחשבים) עם אסטרדיול (E2) – או 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) – מאוגד LBD הדימרים2,3. התחום ERα F (חומצות אמינו 45) להתחבר סליל 12 ישירות. עם זאת, יש אין מידע לגבי ההשפעה של הרחבה זו של חומצות אמינו 45 (תחום F) מ הסליל 12-dimerization ERα LBD. במחקר זה, נדגים את התרומה של התחום F בו homodimerization ERα LBD תלויי-4OHT תלויי מין תוך שימוש assay (M2H) של שני-היברידית יונקים.
הבדיקה M2H היא שיטה להפגין אינטראקציות חלבון בתאים בתרבית של מציגה את DNAs פלסמיד אחר שלושה: שני פלסמידים ביטוי חלבון, אשר אקספרס GAL4 DNA מחייב תחום (DBD) fusion פיוז’ן ERα LBD ו VP16AD ERα LBD, ו- a לוציפראז התמזגו GAL4RE ביטוי כתב פלסמיד. מתי הפיוז’ן GAL4DBD ERα LBD ופיוז’ן VP16AD ERα LBD אינטראקציה (להפוך דיימר) בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז באמצעות הפונקציה transactivation תלויי-VP16AD. ניתן להעריך את רמת LBD homodimerization על ידי הפעילות לוציפראז.
וזמינותו שמרים 2-היברידית (Y2H) היא שיטה חלופית המבוססת על אותו עיקרון המשתמשת שמרים כמו הסביבה המארח. בדו”חות קודמים באמצעות מערכת Y2H הוכיח כי F-תחום-קטום LBD ERα האנושי מגביר גיוס coactivator תלויי-E2, מסכמים כי התחום F מונעת שעתוק בתיווך E24. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים אשר הדגימו פעילות גנים ברמת השעתוק הקלוש של F-תחום-נחתך ERα האנושי ב-5,בתרבית של תאים6. לאחרונה, המחקר שלנו, באמצעות מערכת M2H, הפגינו פעילות גיוס coactivator תלויי-E2 LBD ERα האנושי מופחת לפי F לחיתוך תחום בתאים בתרבית של וזה עולה בקנה אחד עם פעילות שעתוק1. מקרים אלה מצביעים על תפקיד פיזיולוגי אינטראקציית חלבון-חלבון שונה באופן ספציפי סוג התא, ההקשר. וזמינותו M2H יכולים להפגין פעילות אינטראקציה חלבון באותו הקשר הסלולר המשמש לקביעת תעתיק הפעילות. זה מספק יתרון של וזמינותו M2H לעומת Y2H או אחרים במבחנה חלבון אינטראקציה ניתוחים.
נותרו שאלות הנוגעות המנגנונים המולקולריים של הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (SERMs) (למשל, 4OHT) כדי לווסת את תמלול בתיווך ERα. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את מנגנון הפעילות אגוניסט חלקי של SERMs בסוגים שונים בתרבית של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במסמך זה, אנחנו תיאר את פרוטוקול וזמינותו M2H, התמקדות התנאים assay לגילוי הפעילות homodimerization של ERα LBD כדוגמה. באופן כללי, וזמינותו M2H הוא לא פופולרי להערכה של תלויות ליגנד-ERα LBD dimerization פעילות. זאת בשל LBD ERα הפו פונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק; הפעילות אשר מפריע, במקרים מסוימים, תוצאות וזמינותו M2H. עם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ד”ר Sueyoshi ו וואנג-נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד, וכן טאנר ג’פרסון על ביצוע הליכים על הוידאו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1ZIAES070065 (ל K.S.K.) מן החלוקה של מגזר בחקר NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
