포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지
Summary
우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.
Abstract
에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. ERα 단백질의 순서는 높은 종 가운데 보존 됩니다. 그것은 인간의 기능 및 마우스 ERαs는 동일 생각 되었습니다. 우리는 쥐와 인간 ERα ligand 바인딩 도메인 (LBD) 이합체 화 활동 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 차동 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT) 효과를 보여줍니다. M2H 분석 결과 LBD homodimerization 활동의 포유류 세포, 2 개의 단백질 식 플라스 미드 (GAL4 DNA 바인딩 도메인 [DBD] 퓨전 LBD와 VP16 transactivation 도메인 [VP16AD] 퓨전 LBD)의 transfection를 활용 하 여 효율을 보여줄 수와 GAL4 응답 요소 (GAL4RE) 융합 luciferase 기자 플라스 미드. 때 GAL4DBD 퓨전 LBD와 VP16AD 퓨전 LBD는 이합체 셀에, 복잡 한이 단백질이는 GAL4RE를 한다, 다음, VP16AD 종속 전사 활동을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. 4OHT 중재 luciferase 활성화는 마우스 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 보다 인간 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 transfected 세포에서와 페 된 HepG2 세포에서 높다. 이 결과 4OHT 종속 마우스 ERα LBD homodimerization 활동의 효능은 인간의 ERα LBD 보다 나왔다. Agonistic ligands LBD 활동의 기저 수준 향상과 그 LBD 이합체 화 활동의 탐지를 방해 하기 때문에 일반적으로, M2H 분석 결과의 활용, 핵 수용 체 LBD 이합체 화 활동의 평가 위해 적합 하지 않습니다. 우리는 4OHT ERα LBD 기저 활동을 강화 하지 않습니다 발견. 그것은 결정 하 고 성공적으로 M2H 분석 결과 사용 하 여 4OHT 종속 LBD 이합체 화 활동 감지 수 있는 위한 핵심 요소 이다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 선택적 에스트로겐 수용 체 변조기 (예, 4OHT)의 부분적인 주 작동 근 활동 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. 아미노산 sequenceof ERα이 높은 종 가운데 보존 됩니다. 인간 사이의 높은 상 동 때문에 및 ERα 마우스,이 수용 체의 기능으로 동일의 생각 하 고 그 종에서 estrogenic 물질 (예, tamoxifen)의 차동 활동은 종족의 차이에 의해 발생 화학 물질 대사 보다는 ERα의 구조적 차이 의해. ERα 높은 F 도메인 A를 지정 하는 핵 수용 체 (NR) superfamily 중 공통 되는 도메인 구조를 보존 했다. E 도메인 또는 ligand 바인딩 도메인 (LBD) 포함 ligand 바인딩 주머니와 transcriptional 활성화 기능 2, AF-2 라는. F 도메인 E 도메인에 인접 한 지역화 이며이 NRs 중 가장 변수 도메인. 인간 사이도 마우스 ERα, F 도메인의 homology 다른 도메인1보다 크게 낮습니다. Ligand 바인딩 ERα LBD ligand 의존 유전자 전사 (ERα의 고전 액션) 규제에 대 한 직접 특정 스 트로 겐-응답 DNA 요소를 바인딩할 ERα 단백질의 homodimerization 향상. 결정학 연구 LBD 이합체2,3바운드 나선 estradiol (e 2)-또는 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT)-12 (AF-2 핵심 도메인)의 차동 위치를 계시 했다. ERα F 도메인 (45 아미노산) 나선 12를 직접 연결 합니다. 그러나, ERα LBD 이합체 화에 나선 12에서에서 45 아미노산 (F 도메인)의이 확장의 효과 관한 어떠한 정보도가 있다. 이 연구는 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 종의 4OHT 종속 ERα LBD homodimerization F 도메인의 기여 보여 줍니다.
M2H 분석 결과 3 개의 다른 플라스 미드 DNAs를 소개 하는 포유류 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 설명 하는 방법: GAL4 DNA 바인딩 도메인 (DBD) 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD, 표현 하는 두 단백질 식 플라스와 GAL4RE 융합 luciferase 식 기자 플라스 미드 GAL4DBD 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD의 상호 작용 (게는 이합체)는 세포에이 단백질 복잡 한에 GAL4RE 바인딩하고, 다음, VP16AD-종속 transactivation 기능을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. LBD homodimerization의 수준 luciferase 활동에 의해 평가할 수 있습니다.
효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 호스트 환경으로 누 룩을 사용 하는 동일한 원리에 따라 대체 방법입니다. Y2H 시스템을 사용 하 여 이전 보고서 인간 ERα LBD F 도메인 잘립니다 F 도메인 E2 중재 전사4방지 결론 E2-종속 coactivator 모집 증가 설명 했다. 이 결과 포유류 세포5,6에 인간 ERα F 도메인 잘릴 감쇠 transcriptional 활동 증명 다른 보고서와 일치 하지 않습니다. 최근, M2H 시스템을 사용 하 여 우리의 연구는 인간 ERα LBD의 E2-종속 coactivator 모집 활동 F 도메인 잘림 포유류 세포에 의해 감소 하 고 전사 활동1와 일치 하는 설명 했다. 이러한 관측 단백질 단백질 상호 작용의 생리 적 역할 컨텍스트에 셀 형식별 방식으로 다른 것이 좋습니다. M2H 분석 transcriptional 활동을 결정 하는 데 사용 되는 동일한 세포 컨텍스트에서 단백질 단백질 상호 작용 활동을 설명할 수 있다. 이 Y2H 또는 다른 시험관에 단백질-단백질 상호 작용 분석에 비해 M2H 분석 결과의 이점을 제공 합니다.
선택적 에스트로겐 수용 체 (serm) (예, 4OHT) ERα 중재 전사 조절 하의 부분적인 주 작동 근 활동의 분자 메커니즘에 대 한 질문에 남아 있다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 SERMs의 부분적인 주 작동 근 활동의 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 예를 들어 ERα LBD의 homodimerization 활동을 탐지 하기 위한 시험 조건에 초점을 맞추고 M2H 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 일반적으로, M2H 분석 결과 ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동의 평가 대 한 인기가 되지 않습니다. 이것은 보유 transcriptional 활성화 함수; ERα LBD 활동 방해, 경우도 M2H 분석 결과의 결과. 그러나, 우리가 여기 보여줍니다 M2H 분석 결과 LBD (예를 들어, 4OHT…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 감사 박사 스에요시와 왕에서 국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 원고, 태 너 제퍼슨의 그들의 중요 한 독서에 대 한 비디오에서 절차를 수행. 이 작품은 NIEHS의 교내 연구 부문에서에서 (K.S.K.)에 국가 학회 건강 그랜트 1ZIAES070065에 의해 지원 되었다.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
