Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi
Summary
Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell’estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l’analisi di due-ibrido dei mammiferi.
Abstract
Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza della proteina ERα è altamente conservata tra le specie. Si è pensato che la funzione dell’essere umano e il mouse ERαs è identico. Dimostriamo l’effetto differenziale 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) il mouse e attività dimerizzazione del dominio (LBD) del ligand-legantesi ERα umana usando l’analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi. Il dosaggio di M2H in grado di dimostrare l’efficienza delle attività di omodimerizzazione LBD in cellule di mammifero, che utilizzano la transfezione di due plasmidi di espressione della proteina (GAL4 DNA-binding dominio [DBD] fusione LBD e VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusione LBD) e un Elemento Gal4-sensible a reagire (GAL4RE) fuso plasmide del reporter di luciferase. Quando la fusione GAL4DBD LBD e la fusione di VP16AD LBD fanno un dimero nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva un’espressione di gene della luciferasi attraverso l’attività di trascrizione dipendente VP16AD. L’attivazione di 4OHT-mediata luciferasi è maggiore nelle cellule HepG2 che sono state trasfettate con i plasmidi della espressione di proteina fusione ERα LBD di mouse rispetto nelle cellule del plasmide transfettata espressione umane del proteina fusione ERα LBD. Questo risultato suggerisce che l’efficacia del mouse 4OHT-dipendente attività omodimerizzazione ERα LBD è superiore umano ERα LBD. In generale, l’utilizzo del dosaggio M2H non è ideale per la valutazione dell’attività di dimerizzazione LBD recettore nucleare, perché agonistiche ligandi che permettono di migliorare il livello basale dell’attività LBD e che impedisce la rilevazione di attività di dimerizzazione LBD. Abbiamo trovato che 4OHT non migliora l’attività basale ERα LBD. Che è un fattore chiave per essere in grado di determinare e rilevare l’attività di dimerizzazione di LBD 4OHT-dipendente per con successo usando l’analisi M2H. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare l’attività agonista parziale dei modulatori del recettore estrogeno selettivo (ad esempio, 4OHT) in vari tipi di cellule di mammifero.
Introduction
Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza dell’amminoacido ERα è altamente conservata tra le specie. A causa di più alta omologia tra umani ed ERα il mouse, la funzione di questi recettori è pensata come identici, e l’attività differenziale di sostanze estrogeniche (ad es., tamoxifene) in quelle specie è causato da differenze della specie in metabolismi chimici piuttosto che dalle differenze strutturali di ERα. ERα è altamente conservata strutture di dominio che sono comuni tra la superfamiglia dei recettori nucleari (NR), designato ai domini di F. E dominio o dominio di legame al ligando (LBD) include la tasca di ligand-legantesi e la funzione di attivazione trascrizionale 2, denominata AF-2. Il dominio di F è localizzato immediatamente adiacente al dominio E ed è il dominio più variabile tra la NRs. Anche tra umani e mouse ERα, omologia del dominio di F è notevolmente inferiore a quello di altri domini1. Il LBD-ligando di ERα migliora la dimerizzazione della proteina ERα per associare l’elemento specifico di DNA estrogeno-rispondente direttamente per regolare la trascrizione genica di ligando-dipendenti (classica azione di ERα). Studi cristallografici hanno rivelato il posizionamento differenziale dell’elica 12 (AF-2 core domain) con estradiolo (E2) – o 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) – associato LBD dimeri2,3. Il dominio di ERα F (45 aminoacidi) collegare elica 12 direttamente. Tuttavia, non c’è nessuna informazione per quanto riguarda l’effetto di questa estensione di 45 aminoacidi (dominio F) dall’elica 12 sulla dimerizzazione di ERα LBD. In questo studio, dimostriamo il contributo del dominio F per la specie-4OHT-dipendente ERα LBD omodimerizzazione usando un’analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi.
Il dosaggio di M2H è un metodo per dimostrare le interazioni proteina-proteina in cellule di mammifero introducendo le tre differenti plasmide DNAs: due plasmidi di espressione della proteina, che esprimono la fusione di dominio (DBD) GAL4 DNA-legantesi ERα LBD e VP16AD fusione ERα LBD, e un GAL4RE-fuse luciferasi espressione del reporter del. Quando la fusione GAL4DBD ERα LBD e la fusione di VP16AD ERα LBD interagire (fare un dimero) nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva l’espressione di gene di luciferase attraverso la funzione di transattivazione di VP16AD-dipendente. Il livello di LBD omodimerizzazione può essere valutato con l’attività luciferasica.
Il dosaggio di lievito due-ibrido (Y2H) è un metodo alternativo basato sullo stesso principio che utilizza lievito come l’ambiente host. Utilizzando il sistema di Y2H i rapporti precedenti hanno dimostrato che F-dominio-troncato umano ERα LBD aumenta reclutamento di coactivator di E2-dependent, concludendo che il dominio di F previene E2-mediata trascrizione4. Questo risultato è coerente con altri rapporti che hanno dimostrato l’attività trascrizionale attenuato di F-dominio-troncato ERα umano in cellule di mammiferi5,6. Recentemente, il nostro studio, utilizzando il sistema M2H, ha dimostrato che l’attività di reclutamento di coactivator E2-dipendente di umano ERα LBD è diminuito del troncamento del dominio di F in cellule di mammiferi ed è coerenza con la trascrizione attività1. Queste osservazioni suggeriscono che il ruolo fisiologico di interazione proteina-proteina differisce in un modo specifico del tipo di cella e contesto. Il dosaggio di M2H può dimostrare attività di interazione proteina-proteina nello stesso contesto cellulare che viene utilizzato per determinare l’attività trascrizionale. Ciò fornisce un vantaggio del dosaggio M2H rispetto alla Y2H o altre analisi di interazione proteina-proteina in vitro .
Ci rimangono domande per quanto riguarda i meccanismi molecolari dell’attività agonista parziale di modulatori dei recettori selettivi dell’estrogeno (SERMs)(ad esempio, 4OHT) per regolare la trascrizione ERα-mediata. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare il meccanismo dell’attività agonista parziale di SERMs in vari tipi di cellule di mammifero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto il protocollo per il dosaggio di M2H, concentrandosi sulle condizioni di test per rilevare l’attività di omodimerizzazione di ERα LBD come esempio. In generale, il dosaggio di M2H non è popolare per la valutazione delle attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente. Ciò è dovuto il ERα LBD che possiede una funzione di attivazione trascrizionale; la cui attività si disturba, in alcuni casi, i risultati del dosaggio M2H. Tuttavia, come dimostriamo qui, l’analisi di M2H può essere us…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la d. ssa Sueyoshi e Wang presso il National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) per la loro lettura critica del manoscritto e Tanner Jefferson per l’esecuzione di procedure sul video. Questo lavoro è stato supportato dalla 1ZIAES070065 di istituti nazionali di salute Grant (a K.S.K.) dalla divisione di ricerca intramurale del NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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