Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Summary

Questo protocollo è progettato per valutare la citotossicità T-cellula (auto T-cellula) reindirizzata immunoterapia contro le cellule cancerose strutturate 3D (sferoidi) in tempo reale.

Abstract

L’immunoterapia è diventata un campo di crescente interesse nella lotta contro il cancro altrimenti intrattabile. Tra tutti i metodi immunotherapeutic, recettore chimerico antigene (auto) Reindirizzamento cellule T ottenute i risultati più spettacolari, in particolare con la leucemia linfoblastica acuta B pediatrica (B-ALL). Metodi di convalida classica delle cellule di T auto si basano sull’uso di specificità e test di funzionalità delle cellule T auto contro le cellule bersaglio in sospensione e in modelli di xenotrapianto. Purtroppo, le osservazioni fatte in vitro spesso sono disaccoppiate dai risultati ottenuti in vivo e un sacco di fatica e animali potrebbe essere risparmiato con l’aggiunta di un altro passo: l’uso della cultura 3D. La produzione di sferoidi fuori potenziali cellule bersaglio che imitano la struttura 3D delle cellule del tumore, quando essi sono innestate nel modello animale rappresenta l’alternativa ideale. Qui, segnaliamo un metodo conveniente, affidabile e facile da produrre sferoidi da una linea cellulare colorettale trasdotte come uno strumento di convalida per la terapia cellulare adottiva (esemplificato qui dalle cellule di T auto CD19). Questo metodo è accoppiato con un avanzato sistema di imaging dal vivo che possa seguire la crescita della sferoide, effettrici cellule apoptosi delle cellule del tumore e citotossicità.

Introduction

Trasferimento adottivo di cellule (ACT) rappresenta il trattamento di cancro di generazione successivo. Essa si basa sull’iniezione di cellule effettrici (T – o cellule NK) in un paziente. Queste cellule possono essere geneticamente modificate con un recettore che li guiderà alla loro destinazione, il tumore e distruggerlo. Recentemente questo approccio è stato indicato per essere fattibile quando un recettore chimerico antigene (auto) diretto contro il marcatore di cellule B CD19 è stato introdotto nelle cellule del paziente T per uccidere il suo cancro¹. Nel caso di auto, che è un recettore artificiale, il disegno consiste di frammenti anticorpali specifici, l’antigene vincolante dominio ridotto a un frammento di variabile entità designata a singola catena (scFv), legata ai domini di segnalazione del T-cell. Anche se ci sono parecchi disegni, le versioni più comunemente usate di cui come seconda generazione auto disegni, costituito da CD3z per la segnalazione di TCR e un dominio di costimolazione (CD28, 4-1BB, OX40, ecc.) ^{1 , 2}. il campo di immunoterapia diretto la maggior parte della sua attenzione a questa nuova forma di atto quando CD19 auto-T cellule trattate efficacemente numerosi pazienti con le malignità delle cellule di B^3,4. Dopo questo successo, i ricercatori hanno cercarono di sfruttare i disegni simili prendendo di mira altri epitopi per tumori solidi con successo limitato. Purtroppo, la scarsità di antigeni specifici del tumore e le più severe microambienti di tumore resi auto T cellule meno efficace nei confronti di tumori solidi⁵.

Attualmente, le strategie di convalida più comunemente usato in vitro si basano su sistemi bidimensionali (2D) che interessano solo un frammento delle sfide già citato tumore solido. Classicamente, 2D in vitro sistemi coinvolgono una miscela delle cellule T auto e linee cellulari del cancro di destinazione come strati monomolecolari per valutare la funzionalità e la specificità di queste cellule effettrici. Anche se queste strategie sono parti importanti e vitali degli studi, non prendono in considerazione la complessa morfologia e struttura tridimensionale (3D) del cancro cellule⁶. Le cellule tumorali coltivate in sistemi 3D, definito come sferoidi, acquisiscono nuovi tratti fenotipici attraverso cambiamenti nel gene espressione profilo⁷, che possa influenzare il riconoscimento di cellule effettrici reindirizzata. Birgersdotter e colleghi hanno dimostrato che una linea cellulare di linfoma (HL) Hodgkin quando coltivata solo in un modello 3D cultura acquisisce un profilo di espressione genica che è simile al tumore primario campioni⁸. Di conseguenza, sferoidi o 3D simile cultura offerta di metodologie più pertinenti in modelli in vitro al contrario di sistemi 2D standard. Tali sistemi sono anche simili a studi in vivo, che sono visti come il passo finale nel processo di convalida di una determinata macchina. Considerando che i sistemi 2D non riescono a imitare la morfologia dei cluster di cancro, sferoidi offrono formazioni simili per valutare la funzionalità delle cellule di T auto prima di modelli in vivo. In uno studio, Pickl et al. identificato che un modello di sferoide del recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER2) che overexpressing le cellule tumorali hanno dimostrato profili simili segnalazione a modelli in vivo⁹. Questo ulteriore sostiene che sferoidi offrono più pertinenti e close-in vivo valutazione delle cellule di T di auto. Inoltre, convalida di auto T-cellula contro sferoidi potrebbe aiutare valutare la loro efficacia più criticamente e impedire alcuni dei disegni di trasferirsi in vivo gli studi prematuramente¹⁰; contribuendo in tal modo, alla ricerca eticamente interessato sacrificando meno animali. Inoltre, protocolli utilizzando sferoidi non sono più costosi rispetto ai classici sistemi 2D e molto più veloce rispetto alla classica in vivo studi. Presi insieme, si può prevedere che l’inclusione degli studi sferoide diventerà presto la pratica standard per collegare gli studi in vitro e in vivo.

Qui, presentiamo la preparazione di sferoidi dalla linea cellulare del cancro del colon HCT 116. Questa linea cellulare è stata modificata per esprimere la molecola CD19 umana rendono sensibile ai linfociti CD19 auto e fornire una chiara valutazione dell’uccisione mediante un costrutto auto clinicamente validato.

Protocol

1. generazione di sferoidi dalla linea cellulare di cancro colorettale Monostrati di cellule umane lavare HCT 116 (stabilmente transduced per esprimere Cluster di differenziazione 19 (CD19) e proteina di fluorescenza verde (GFP)) con fosfato tampone salino (PBS; 5 mL per un 25 cm2 o 10 mL per un pallone da2 di 75 cm). Aggiungere la tripsina (0,5 mL per un 25 cm2 o 1 mL per un pallone da2 di 75 cm) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Controllare il dis…

Representative Results

Come si può vedere nella Figura 1, è fondamentale controllare tramite flusso cytometry il livello di espressione di CD19 auto sulle cellule di T (Figura 1A) e il livello di CD19 su linee cellulari tumorali di HCT116 (Figura 1B). Figura 2 esemplifica il risultato di un esperimento tipico sferoide. L’apparato di imaging automatizzato prende le immagini in quattro diversi…

Discussion

L’uso di sferoidi come strumento innovativo per convalidare il trattamento del cancro futuro è diventato un campo di crescente interesse negli ultimi anni. Sferoidi rappresentano un passaggio intermedio tra il classico 2D analisi in vitro e valutazione in vivo. Il metodo ulteriormente tiene un sacco di promesse per quanto riguarda la loro potenza in termini di che imita il micro-ambiente del tumore così come gene profiling⁷. Il protocollo presentato in questa pubblicazione è stato adattato da s…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience