Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil
Summary
Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.
Abstract
Telomer, sebebiyet veren telomeric için tekrar içeren-uzun kodlamayan RNA’ların (TERRA), hangi heterochromatin oluşumu ve telomer uzunluğu homeostasis gibi telomer biyolojide önemli rol oynarlar önerilen transkripsiyonu. Son bulgular TERRA molekülleri Ayrıca gen ekspresyonu fare embriyonik kök (ES) hücre içinde düzenlemek için iç kromozom bölgeleri ile etkileşim ortaya koydu. Bu kanıtlar doğrultusunda sadece bir alt RNA floresans in situ hibridizasyon (RNA-balık) analizleri göstermiştir TERRA tutanaklar kromozom uçlarında yerelleştirilmesine. TERRA molekülleri dinamiklerini daha iyi anlaşılmasını işlev ve mekanizmaları eylem tanımlamak yardımcı olur. Burada, etiket ve tek-telomer TERRA transkript kanser hücrelerinde MS2 GFP sistemini kullanarak görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu amaçla, biz AGS insan mide kanseri hücre kültürünü tek bir subtelomere entegre MS2 dizileri içeren kullanarak istikrarlı klonlar, oluşturmak için bir protokol mevcut. TERRA transkripsiyon MS2 öğesini telomer üzerinden canlı hücre floresans mikroskobu GFP (MS2-GFP) erimiş MS2 RNA-bağlayıcı proteinin ortak ifade üzerine tarafından görüntülenmiştir MS2 öğesini TERRA molekülleri ifade sonuçlanır. Tek-telomer TERRA molekülleri kanser hücrelerinin dinamiklerini incelemek araştırmacılar bu yaklaşım sağlar ve diğer hücre hatları için uygulanabilir.
Introduction
Uzun kodlamayan RNA TERRA kromozomlar subtelomeric bölgesinden sentezlenir ve onun transkripsiyon içinde telomeric tekrar yolu1,2sonlandırma kromozom uçları doğru devam eder. Bu nedenle, TERRA transkript vasıl onların son 5′ subtelomeric kaynaklı sıralarının oluşur ve telomeric tekrarlar (omurgalılarda UUAGGG)3ile bitirmek. Önemli rolleri önerdi TERRA için telomerlerin4,5, DNA çoğaltma6kromozom arasında Homolog rekombinasyon teşvik, heterochromatin formasyonu da dahil olmak üzere7,8 biter , telomer yapısını10ve telomer uzunluğu homeostazı2,11,12,13düzenleyen 9. Ayrıca, TERRA transkript yaygın gen ekspresyonu fare embriyonik kök (ES) hücreleri14düzenleyen sayısız extratelomeric siteleri ile etkileşim. Bunlar doğrultusunda (RNA-balık) analizleri yalnızca alt küme küme küme kümesini TERRA transkript göstermiştir kanıt, RNA floresans in situ hibridizasyon yerelleştirmek telomerlerin1,2,15‘ de. Buna ek olarak, TERRA formu nükleer toplamları fare hücreleri2,16X ve Y kromozomu, yerelleştirme bildirilmiştir. Bu bulgular TERRA transkript çekirdek içinde karmaşık dynamics geçmesi göstermektedir. TERRA molekülleri dinamiklerini anlamak, işlev ve mekanizmaları eylem tanımlamak yardımcı olacaktır.
MS2 GFP sistem, canlı hücreler çeşitli organizmalar17,18RNA molekülleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu sistem daha önce etiket ve tek-telomer TERRA molekülleri S. cerevisiae12,19görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu sistemi kullanarak, bu son zamanlarda Maya TERRA tutanaklar içinde sitoplazma post-diauxic shift aşamasında TERRA extranuclear işlevleri20uygulamayın düşündüren yerelleştirmek gösterilmiştir. Son zamanlarda tek-telomer TERRA transkript kanser hücreleri21çalışmaya MS2 GFP sistemi kullandık. Bu amaç için MS2 dizileri tek telomer (telomer 15q, bundan sonra Tel15q), entegre etmek için CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracı istihdam ve klonlar MS2 öğesini endojen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonları) ifade elde. Tanıyan ve yaşam MS2 RNA sıralarını etkinleştirir görselleştirme tek-telomer TERRA transkript bağlar GFP erimiş MS2 RNA-bağlayıcı protein (MS2-GFP) ortak ifade21hücreleri. TERRA-MS2 klonlar üretimi için gereken adımları ayrıntılı olarak açıklamak için burada resimli Protokolü amacı budur.
TERRA-MS2 klonlar üretmek için MS2 kaset telomer 15q, bölgenin subtelomeric tümleşiktir, TERRA organizatörü bölge ve transkripsiyon başlangıç sitesi aşağı akım. Füme balığı-p siteleri tarafından çevrili bir paromisin direnç gen MS2 kaset içerir ve onun entegrasyon subtelomere 15q, CRISPR/Cas9 sistem22kullanılarak gerçekleştirilir. Kaset, tek klonlar MS2 transfection seçilir ve subtelomeric entegrasyon-in kaset PCR tarafından doğrulandıktan sonra DNA sekanslama ve Güney leke. Pozitif klonlar Cre ifade adenovirus ile sadece MS2 dizileri ve subtelomere 15q tek somon balığı-p sitesinde bırakarak kasete, seçim işaretçisi kaldırmak için bulaşmış. TERRA MS2 öğesini transkript Tel15q üzerinden ifade RT-qPCR tarafından doğrulanır. Son olarak, MS2 GFP füzyon protein ifade edilir MS2-TERRA transkript floresans mikroskobu tarafından görselleştirmek için retroviral enfeksiyon via TERRA-MS2 klonlar içinde. TERRA transkript RNA-balık tarafından kolayca tespit edilebilir ve1,2,15,23telomeric tekrar özel kullanarak canlı hücre görüntüleme sondalar. Bu yaklaşımlar TERRA molekülleri tek hücre çözünürlükte toplam nüfusu lokalizasyonu üzerinde önemli bilgiler sağlar. Klonlar MS2 dizileri, tek bir subtelomere içeren nesil araştırmacılar tek-telomer TERRA transkript işlevi ve mekanizmaları TERRA eylem tanımlamak yardımcı olacaktır canlı hücrelerdeki dinamikleri çalışmaya olanak sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede biz insan kanser hücre klonlar subtelomere 15q içinde entegre MS2 dizileri içeren oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu klonlar kullanma, subtelomere 15q transkripsiyonu MS2 öğesini TERRA molekülleri floresans mikroskobu tarafından MS2 GFP füzyon protein ortak ifade tarafından tespit edilir. Bu yaklaşım tek bir ifade TERRA dinamiklerini incelemek araştırmacılar sağlar telomer yaşayan hücreleri21. Bu protokol için TERRA-MS2 klonlar TERRA, TERRA ifade upregulated ins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CIBIO Trento Üniversitesi, gelişmiş görüntüleme tesis ve Viyana BioOptics ışık mikroskobu tesiste Max F. Perutz Laboratuvarları (MFPL), personel için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma Mahlke-Obermann Vakfı ve Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı araştırma, teknolojik gelişim ve gösteri için hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 609431 EC için fon aldı EC bir Rita Levi Montalcini bursu Eğitim Üniversite ve araştırma (MIUR) İtalyanca Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
