生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成
Summary
ここでは、単一 subtelomere で MS2 シーケンス タグを含む癌細胞のクローンを生成するためのプロトコルを提案する.MS2 GFP システムに依存して、このアプローチは、内因性の転写産物のテロメア繰り返し含む RNA (テラ) 生きている細胞の単一テロメアから表現の可視化を実現。 にします。
Abstract
テロメアは、転写、テロメア長鎖非コード Rna (テラ) の繰り返しを含むに上昇を与えるテロメア生物学、ヘテロクロマチン形成とテロメアの長さの恒常性などで重要な役割を果たしているが提案されています。最近の知見では、テラの分子はまたマウス胚性幹 (ES) 細胞における遺伝子発現を調整するために内部の染色体領域と対話することを明らかにしました。この証拠に沿った RNA 蛍光の in situハイブリダイゼーション (RNA 魚) 分析サブセットのみが示されている染色体の両端にテラのトラン スクリプトをローカライズします。テラ分子のダイナミクスの理解は、彼らの機能と作用機構を定義に役立ちます。ここでは、ラベルし、MS2 GFP を用いた癌細胞の単一テロメア テラ転写物を可視化する手法について述べる。この目的に単一の subtelomere で統合 MS2 シーケンスを含んでいる AGS ヒト胃がん細胞ラインを使用して安定したクローンを生成するプロトコルを提案します。MS2 タグ テロメアからテラの転写は、GFP (MS2 GFP) を融合した MS2 RNA 結合タンパク質の共発現時に生細胞の蛍光顕微鏡による可視化 MS2 タグ テラ分子の発現の結果します。このアプローチにより、癌細胞の単一テロメア テラ分子のダイナミクスを研究する研究者とその他の細胞に適用できます。
Introduction
染色体の subtelomeric 領域から長鎖非コード RNA テラを転写し、その転写染色体はテロメアの繰り返し管1,2内終了終了へ向かって。このため、テラの成績証明書は 5′ 端に subtelomeric の派生シーケンスから成り、テロメアの繰り返し (脊椎動物の UUAGGG)3で終了します。重要な役割は、テロメア4,5, DNA 複製6、染色体の間での相同組換えの促進のヘテロクロマチン形成を含む終了する7,8テラ、提案されています。,9、テロメア構造10およびテロメアの長さの恒常性2,11,12,13を規制します。さらに、テラの成績証明書は、マウス胚性幹 (ES) 細胞14における広範な遺伝子発現を調節する多数の extratelomeric サイトと対話します。これらに伴い、RNA 蛍光性の現場の交配 (RNA 魚) 解析はテラ成績のサブセットのみを示している証拠はテロメア1,2,15ローカライズします。さらには、テラはマウス細胞2,16の X および Y 染色体でローカライズする原子集合体を形成する報告されています。テラ成績が核内の複雑なダイナミクスを受けることが示唆されました。テラ分子のダイナミクスを理解し彼らの機能と作用機構を定義するのに役立ちます。
MS2 GFP システムは、広く様々 な生物17,18から細胞内 RNA 分子を可視化するために使用されています。このシステムは、タグを出芽酵母12,19のシングル テロメア テラ分子を可視化する以前使用されています。このシステムを使用すると、最近、酵母テラ成績証明書をポスト発酵から呼吸へシフト フェーズでローカライズ細胞質内テラ可能性がありますにおける核外機能20を及ぼすことを示唆しているが示されました。最近がん細胞21シングル テロメア テラ トラン スクリプトを勉強する MS2 GFP システムを使いました。この目的には、MS2 単一テロメア (テロメア 15q、以下 Tel15q) でシーケンスを統合する CRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを採用し、MS2 タグ内因性 Tel15q テラ (テラ MS2 クローン) の表現のクローンを得た。認識し、生活で単一テロメア テラ成績の MS2 RNA シーケンスにより可視化を結合する GFP 融合 MS2 RNA 結合タンパク質 (MS2 GFP) の共発現細胞21です。ここに示されているプロトコルの目的は、テラ MS2 クローンの生成のために必要な手順の詳細に説明することです。
テロメア 15q、subtelomeric 地域で統合され、MS2 カセット テラ MS2 のクローンを生成するテラ プロモーター領域と転写開始部位の下流。MS2 カセットには lox p サイトに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が含まれています、subtelomere 15q での統合は、CRISPR/Cas9 システム22を使用して実行されます。カセット、単一クローン MS2 のトランスフェクションが選択され PCR によってカセットの subtelomeric 統合が確認されたら、DNA 配列と南部のしみ。肯定的なクローンは、subtelomere 15q で単一 lox p サイト MS2 シーケンスだけを残して、カセットの選択マーカーを除去するために Cre を発現アデノ ウイルスに感染しています。RT qPCR により Tel15q からタグ付きの MS2 のテラの式を確認すると.最後に、MS2 GFP の融合蛋白質を表現に蛍光顕微鏡による MS2 テラ成績を視覚化するためにレトロ ウイルス感染テラ MS2 クローンで。RNA 魚でテラの成績証明書を容易に検出できるし、テロメア繰り返し固有を使用して生細胞イメージング プローブ1,2,15,23。これらのアプローチは、単一セルの解像度でテラ分子の総人口の局在に関する重要な情報を提供します。単一 subtelomere で MS2 シーケンスを含んでいるクローンの生成には、関数とテラの作用のメカニズムを定義する生きた細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する研究者が有効になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では MS2 シーケンス subtelomere 15q 内に統合を含むひと癌細胞のクローンを生成する手法を提案します。これらのクローンを使用して、subtelomere 15q から転写 MS2 タグ テラ分子は、MS2 GFP 融合タンパク質の共発現による蛍光顕微鏡で検出されます。このアプローチにより、単一から表明したテラのダイナミクスを研究する研究者生活のテロメア細胞21。このプロトコルで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CIBIO トレント大学での高度なイメージング機能、ウィーンの BioOptics 光顕微鏡施設 Max F. ペルーツ研究所 (MFPL) でのスタッフに感謝しております。これらの結果につながる研究資金を受けている Mahlke-谷、同財団、研究、技術開発およびデモンストレーションのため欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムから付与契約の下でない 609431 ecEC は、大学教育と研究 (MIUR) のイタリア省からリタ レヴィ モンタルチーニ交わりによってサポートされます。
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
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