הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.
Abstract
טלומרים משוקלטים, והוליד telomeric המכילים חוזר זמן noncoding RNAs (TERRA), אשר הוצעו כדי לשחק תפקידים חשובים בביולוגיה טלומר, כולל היווצרות הטרוכרומטין טלומר אורך הומאוסטזיס. הממצאים האחרונים גילה כי מולקולות טרה גם לקיים אינטראקציה עם אזורים פנימיים כרומוזומלית להסדיר ביטוי גנים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר. בקנה אחד עם הראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA ניתוחים בחיי עיר הכלאה (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה תעתיקים לשפה קצותיו כרומוזום. הבנה טובה יותר של הדינמיקה של מולקולות טרה נעזור להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאי סרטן באמצעות מערכת MS2-GFP. לכוונה זו, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור שיבוטים יציב, באמצעות AGS שהבטן האנושית סרטן תא קו, המכיל רצפי MS2 משולב ב subtelomere יחיד. תמלול של טרה מ טלומר מתויג MS2 תוצאות הביטוי של מולקולות מתויג MS2 טרה הם דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ על ביטוי משותף של חלבון מחייב MS2 RNA דבוקה GFP (MS2-GFP). גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר טרה מולקולות בתאים סרטניים, ניתן להחיל אותה על שורות תאים אחרים.
Introduction
טרה RNA noncoding זמן הוא עיבד מאזור subtelomeric של כרומוזומים, שעתוק שלה ההכנסות לכיוון הקצוות כרומוזום, הפסקת בתוך בדרכי. אני חוזר telomeric1,2. מסיבה זו, טרה תעתיקים מורכב subtelomeric, נגזר רצפים בסוף 5′ ולסיים עם telomeric חזרה (UUAGGG גולגולת)3. חשוב תפקידי הוצעו על TERRA, כולל הטרוכרומטין היווצרות-טלומרים4,5, ה-DNA שכפול6, קידום רקומבינציה הומולוגית בין כרומוזום מסתיים7,8 , 9, ויסות טלומר מבנה10ו טלומר אורך הומאוסטזיס2,11,12,13. יתר על כן, טרה תעתיקים אינטראקציה עם אתרים רבים extratelomeric להסדיר ביטוי גנים נרחבת תאי גזע עובריים (ES) העכבר14. בקנה אחד עם אלה ראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה ניתוחים (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה הפרוטוקולים לשפה טלומרים1,2,15. בנוסף, טרה דווח טופס גרעיני אגרגטים לוקליזציה על הכרומוזומים X ו- Y העכבר תאים2,16. ממצאים אלה מצביעים על TERRA תעתיקים לעבור דינמיקה מורכבת בתוך הגרעין. הבנת הדינמיקה של מולקולות טרה תסייע להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם.
מערכת MS2-GFP כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש מולקולות RNA בתאים חיים של אורגניזמים שונים17,18. מערכת זו שימש בעבר כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר מולקולות טרה cerevisiae ס12,19. באמצעות מערכת זו, זה היה לאחרונה הוכיח כי שמרים טרה תעתיקים בתרגום בתוך הציטופלסמה במהלך שלב shift פוסט-diauxic, רומז כי טרה לנצל פונקציות extranuclear20. השתמשנו לאחרונה מערכת MS2-GFP ללמוד יחיד-טלומר תעתיקים טרה סרטן תאים21. לכוונה זו, אנחנו מועסקים CRISPR/Cas9 הגנום כלי עריכה כדי לשלב את רצפי MS2 ב טלומר יחיד (טלומר 15q, להלן Tel15q) וקיבלתי שיבוטים ביטוי מתויג MS2 אנדוגני Tel15q טרה (TERRA-MS2 שיבוטים). ביטוי שיתוף התמזגו-GFP MS2 RNA מחייב חלבון (MS2-GFP) מזהה ומאגד רצפי MS2 RNA מאפשר החזיית יחיד-טלומר טרה תעתיקים חי תאים21. המטרה של פרוטוקול מאויר כאן היא לתאר בפירוט את הפעולות הדרושות עבור הדור של טרה-MS2 שיבוטים.
כדי ליצור שיבוטים טרה-MS2, קלטת MS2 משולב בתוך האזור subtelomeric של טלומר 15q, במורד הזרם של טרה יזם האזור ואת שעתוק התחלה האתר. בקלטת MS2 מכילה גן עמידות neomycin ולצדו אתרי סלומון-p, בהיותה אינטגרטיבית-subtelomere 15q מתבצעת באמצעות מערכת CRISPR/Cas922. לאחר תקנים של MS2 קלטת, יחיד שיבוטים שנבחרו subtelomeric שילוב של הקלטת מאומת על ידי ה-PCR, כתם DNA רצף ובדרום. שיבוטים חיובי נגוע אדנו לבטא-Cre למען הסר סמן הבחירה בקלטת, עוזב רק רצפי MS2 ואתר לקס יחיד-p-subtelomere 15q. הביטוי של טרה מתויג MS2 הפרוטוקולים מ Tel15q מאומתת על ידי RT-qPCR. בסופו של דבר, בא לידי ביטוי החלבון פיוז’ן MS2-GFP ב- TERRA-MS2 שיבוטים דרך זיהום retroviral כדי להמחיש תעתיקים MS2-טרה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. טרה תעתיקים אפשר לזהות בקלות בעזרת RNA-דג, הדמיה לחיות תאים באמצעות telomeric חוזר ספציפי רגשים1,2,15,23. גישות אלה לספק מידע חשוב על הלוקליזציה של מכלל האוכלוסייה של טרה מולקולות ברזולוציה תא בודד. הדור של שיבוטים המכיל רצפי MS2 ב subtelomere יחיד יאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאים חיים, אשר יסייע להגדיר את תפקוד ואת מנגנוני הפעולה של טרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה אנו מציגים שיטה לייצר שיבוטים תאים סרטניים אנושיים המכיל רצפי MS2 משולב בתוך subtelomere 15q. באמצעות שיבוטים אלה, מולקולות טרה מתויג MS2 עיבד מ subtelomere 15q מזוהים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ על ידי ביטוי משותף של חלבון פיוז’ן MS2-GFP. גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של טרה הביע א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו אסירי תודה על הסגל של המתקן הדמיה מתקדמות של CIBIO ב אוניברסיטה של טרנטו (trento), המתקן מיקרוסקופ אור BioOptics-מעבדות פרוץ פ מקס (MFPL) בווינה. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן Stiftung Mahlke-Obermann של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, הפגנה תחת גרנט הסכם אין 609431 כדי לכלכלת EC נתמך על ידי מלגת ריטה לוי Montalcini איטלקית משרד החינוך ואוניברסיטת המחקר (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
