कैंसर सेल क्लोन की पीढ़ी Telomeric दोहराने-युक्त आरएनए टेरा कल्पना करने के लिए जीवित कोशिकाओं में एक एकल Telomere से व्यक्त
Summary
यहां, हम एक एकल subtelomere में एक MS2 अनुक्रम टैग युक्त कैंसर सेल क्लोन उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण, MS2 पर भरोसा-GFP प्रणाली, telomeric दोहराने युक्त आरएनए (टेरा) के अंतर्जात टेप के दृश्य में सक्षम बनाता है रहने वाले कोशिकाओं में एक ही telomere से व्यक्त की ।
Abstract
Telomeres लिखित हैं, telomeric दोहराने-युक्त लंबे समय से कोडिंग RNAs (टेरा), जिसमें heterochromatin गठन और telomere लंबाई homeostasis सहित telomere जीवविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का प्रस्ताव किया गया है, को जंम दे रही है । हाल के निष्कर्षों से पता चला कि टेरा अणु भी आंतरिक गुणसूत्र क्षेत्रों के साथ बातचीत करने के लिए माउस भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित । इस प्रमाण के साथ लाइन में, आरएनए प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (आरएनए-मछली) विश्लेषण से पता चला है कि केवल टेरा टेप का एक सबसेट गुणसूत्र में स्थानीयकृत समाप्त होता है । टेरा अणुओं की गतिशीलता की एक बेहतर समझ में मदद मिलेगी उनके समारोह और कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए लेबल और MS2-GFP प्रणाली का उपयोग कर कैंसर की कोशिकाओं में एकल telomere टेरा टेप कल्पना । इस उद्देश्य के लिए, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान स्थिर क्लोन उत्पंन करने के लिए, AGS मानव पेट कैंसर सेल लाइन का उपयोग कर, MS2 एक एकल subtelomere में एकीकृत अनुक्रम युक्त । MS2 से टेरा के प्रतिलेखन-MS2 की अभिव्यक्ति में telomere परिणाम टैग-टेरा अणुओं है कि जी द्वारा कल्पना कर रहे है-सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सह पर एक MS2 आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति GFP (MS2-GFP) से जुड़े । यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को एक कैंसर की कोशिकाओं में telomere टेरा अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है, और यह अंय सेल लाइनों के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
लंबे समय से डिकोडिंग आरएनए टेरा गुणसूत्रों के subtelomeric क्षेत्र से लिखित है और गुणसूत्र की ओर अपनी प्रतिलेखन आय समाप्त होता है, telomeric दोहराने पथ1,2के भीतर समाप्त । इस कारण से, टेरा टेप subtelomeric से मिलकर बनता है-उनके ‘ 5 अंत में दृश्यों व्युत्पंन और telomeric दोहराता के साथ समाप्त (रीढ़ में UUAGGG)3। महत्वपूर्ण भूमिकाओं टेरा के लिए प्रस्तावित किया गया है, telomeres में heterochromatin गठन सहित4,5, डीएनए प्रतिकृति6, गुणसूत्र के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन को बढ़ावा देने के7,8 समाप्त होता है , 9, विनियमन telomere संरचना10और telomere लंबाई homeostasis2,11,12,13। इसके अलावा, टेरा टेप कई extratelomeric साइटों के साथ बातचीत करने के लिए माउस भ्रूण स्टेम में व्यापक जीन अभिव्यक्ति को विनियमित (ES) कोशिकाओं14। इन सबूत के साथ लाइन में, आरएनए प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (आरएनए-मछली) विश्लेषण से पता चला है कि केवल टेरा टेप का एक सबसेट telomeres1,2,15पर information. इसके अतिरिक्त, टेरा को माउस कोशिकाओं2,16में एक्स और वाई गुणसूत्रों में स्थानीयकरण के लिए परमाणु समुच्चय के रूप में सूचित किया गया है । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि टेरा टेप नाभिक के भीतर जटिल गतिशीलता से गुजरना । टेरा अणुओं की गतिशीलता को समझने में मदद उनके समारोह और कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित करेगा ।
MS2-GFP प्रणाली को व्यापक रूप से विभिन्न जीवों17,18से जीवित कोशिकाओं में आरएनए अणुओं कल्पना करने के लिए प्रयोग किया गया है । इस प्रणाली को पहले टैग और एस cerevisiae12,19में एकल telomere टेरा अणुओं कल्पना किया गया है । इस प्रणाली का प्रयोग, यह हाल ही में दिखाया गया है कि खमीर टेरा टेप पोस्ट के दौरान कोशिका द्रव्य के भीतर स्थानीयकरण-diauxic बदलाव चरण, सुझाव है कि टेरा extranuclear कार्यों20लागू हो सकता है । हम हाल ही में उपयोग किया है MS2-GFP प्रणाली के अध्ययन के लिए एकल-telomere टेरा टेप कैंसर कोशिकाओं में21। इस उद्देश्य के लिए, हम CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन उपकरण कार्यरत एक एकल telomere में MS2 दृश्यों को एकीकृत (telomere 15q, इसके बाद Tel15q) और प्राप्त MS2-अंतर्जात Tel15q टेरा (टेरा-MS2 क्लोन)-टैग व्यक्त क्लोन । एक GFP-आपस में जुड़े MS2 आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (MS2-GFP) की सह-अभिव्यक्ति, जो पहचानता है और बांधता है MS2 आरएनए अनुक्रम एकल-telomere टेरा टेप के दृश्य में सक्षम बनाता है रहने वाली कोशिकाओं में21। यहां सचित्र प्रोटोकॉल का उद्देश्य विस्तार में टेरा-MS2 क्लोनों की पीढ़ी के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है ।
टेरा-MS2 क्लोन उत्पंन करने के लिए, एक MS2 कैसेट telomere 15q, टेरा प्रमोटर क्षेत्र और प्रतिलेखन प्रारंभ साइट के बहाव के subtelomeric क्षेत्र के भीतर एकीकृत है । MS2 कैसेट एक निओमायसिन प्रतिरोध लोक्स-पी साइटों द्वारा पार्श्व जीन होता है, और subtelomere 15q में अपने एकीकरण CRISPR/Cas922प्रणाली का उपयोग किया जाता है । MS2 कैसेट के अभिकर्मक के बाद, एकल क्लोन का चयन कर रहे है और कैसेट के subtelomeric एकीकरण पीसीआर, डीएनए अनुक्रमण और दक्षिणी दाग द्वारा सत्यापित है । सकारात्मक क्लोन एक Cre-व्यक्त एडीनोवायरस से संक्रमित करने के लिए कैसेट में चयन मार्कर को दूर करने के लिए, केवल MS2 दृश्यों और एक भी लोक्स-पी साइट subtelomere 15q में छोड़ रहे हैं । MS2 की अभिव्यक्ति-Tel15q से टैग टेरा टेप आरटी द्वारा सत्यापित है-qPCR । अंत में, MS2-GFP फ्यूजन प्रोटीन retroviral संक्रमण के माध्यम से टेरा-MS2 क्लोन में व्यक्त की है क्रम में MS2 माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिदीप्ति-टेरा टेप कल्पना है । टेरा टेप आसानी से आरएनए द्वारा पता लगाया जा सकता है-मछली और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग telomeric दोहराने विशिष्ट जांच1,2,15,23। इन दृष्टिकोण एकल सेल संकल्प पर टेरा अणुओं की कुल जनसंख्या के स्थानीयकरण पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं । एक एकल subtelomere में MS2 दृश्यों युक्त क्लोन की पीढ़ी के शोधकर्ताओं ने एक जीवित कोशिकाओं है, जो समारोह और टेरा की कार्रवाई के तंत्र को परिभाषित करने में मदद मिलेगी में telomere टेरा टेप की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम हो जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में हम मानव कैंसर कोशिका subtelomere 15q भीतर एकीकृत MS2 दृश्यों युक्त क्लोन उत्पंन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इन क्लोनों का प्रयोग, MS2-टेरा subtelomere 15q से प्रतिलिखित अणुओं एक MS2-GFP फ्यूजन प्रोटीन की सह अ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ट्रेंटो के विश्वविद्यालय में CIBIO की उन्नत इमेजिंग सुविधा के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं और वियना में मैक्स एफ Perutz प्रयोगशालाओं (MFPL) में प्रकाशिकी प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा. इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान Mahlke-Obermann Stiftung और यूरोपीय संघ अनुसंधान, तकनीकी विकास और अनुदान समझौते नहीं ६०९४३१ चुनाव आयोग के तहत प्रदर्शन के लिए सातवें ढांचे के कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है । चुनाव आयोग एक रीता लेवी Montalcini फैलोशिप शिक्षा विश्वविद्यालय और अनुसंधान (MIUR) के इतालवी मंत्रालय से समर्थित है ।
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
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