Generering av kreft cellen kloner å visualisere Telomeric gjenta inneholder RNA TERRA uttrykt fra en enkelt Telomere i levende celler
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å generere kreft cellen kloner en MS2 sekvens kode på en enkelt subtelomere. Denne tilnærmingen, avhengig av MS2-GFP systemet, gjør visualisering av endogene transkripsjoner av telomeric gjenta inneholder RNA (TERRA) uttrykt fra en enkelt telomere i levende celler.
Abstract
Telomeres er transkribert, gir opphav til telomeric gjenta inneholder lang noncoding RNAs (TERRA), som har blitt foreslått å spille viktige roller i telomere biologi, inkludert heterochromatin formasjon og telomere lengde homeostase. Nyere funn avslørte at TERRA molekyler også samhandle med interne chromosomal områder å regulere byggkorn under musen embryonic stem (ES) celler. I tråd med dette beviset, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist at bare et delsett av TERRA transkripsjoner lokalisere kromosom slutter. En bedre forståelse av dynamikken i TERRA molekyler bidrar til å definere deres funksjon og virkningsmekanismer. Her beskriver vi en metode for å merke og visualisere single-telomere TERRA utskrifter i celler ved hjelp av MS2-GFP-systemet. Til dette målet presenterer vi en protokoll for å generere stabil kloner, bruker AGS menneskelige mage kreft cellen linjen som inneholder MS2 sekvenser integrert på en enkelt subtelomere. Transkripsjon av TERRA fra MS2-merket telomere gir uttrykk for MS2-merket TERRA molekyler som er visualisert ved live-celle fluorescens mikroskopi på co uttrykk for et MS2 RNA-bindende protein smeltet til GFP (MS2-GFP). Dette gir forskere til å studere dynamikken i enkelt-telomere TERRA molekyler i kreftcellene, og den kan brukes på andre linjer.
Introduction
Den lange noncoding RNA TERRA er transkribert fra subtelomeric regionen av kromosomer, og dens transkripsjon fortsetter mot kromosom endene, avsluttes innen telomeric gjenta spor1,2. Derfor TERRA transkripsjoner består av subtelomeric-avledet sekvenser på 5′ slutten og avslutte med telomeric gjentar (UUAGGG i virveldyr)3. Viktige roller er foreslått for TERRA, inkludert heterochromatin formasjon på telomeres4,5, DNA replikering6, fremme homologe rekombinasjon blant kromosom ender7,8 , 9, regulere telomere struktur10og telomere lengde homeostase2,11,12,13. Videre samhandle TERRA transkripsjoner med mange extratelomeric nettsteder å regulere utbredt byggkorn under musen embryonic stem (ES) celler14. I tråd med dette bevis, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har vist at bare et delsett av TERRA transkripsjoner lokalisere telomeres1,2,15. I tillegg har TERRA blitt rapportert til skjemaet kjernefysiske aggregat lokalisere på X og Y kromosomer i musen celler2,16. Disse funnene tyder på at TERRA transkripsjoner gjennomgå komplekse dynamikken i kjernen. Forstå dynamikken i TERRA molekyler vil bidra til å definere sine funksjon og virkningsmekanismer.
MS2-GFP systemet har vært mye brukt til å visualisere RNA molekyler i levende celler fra ulike organismer17,18. Dette systemet har tidligere blitt brukt til å kode og visualisere single-telomere TERRA molekyler i S. cerevisiae12,19. Bruke dette systemet, var det nylig vist at gjær TERRA transkripsjoner lokalisere i cytoplasma i post-diauxic Skift fasen antyder at TERRA kan utøve extranuclear funksjoner20. Vi har nylig brukt MS2-GFP systemet for å studere single-telomere TERRA utskrifter i kreft celler21. Til dette målet, vi ansatt CRISPR/Cas9 genomet redigering verktøyet å integrere MS2 sekvenser på en enkelt telomere (telomere 15q, senere Tel15q) og fikk kloner uttrykke MS2-merket endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 kloner). Co uttrykk for et GFP-smeltet MS2 RNA-bindende protein (MS2-GFP) som gjenkjenner og binder MS2 RNA sekvenser gjør visualisering av enkelt-telomere TERRA utskrifter i levende celler21. Formålet med protokollen illustrert her er å beskrive i detalj trinnene som kreves for generasjonen av TERRA-MS2 kloner.
Vil generere TERRA-MS2 kloner, kassetteninn MS2 er integrert i subtelomeric regionen av telomere 15q, nedstrøms TERRA promoter regionen og transkripsjon startwebstedet. MS2 kassett inneholder et neomycin motstand gen flankert av lox-p, og integrasjon på subtelomere 15q utføres med CRISPR/Cas9 systemet22. Etter hva av MS2 kassett, enkelt kloner velges og subtelomeric integrering av kassetten er bekreftet av PCR, DNA sekvensering og sørlige blot. Positiv kloner er infisert med en grobunn-uttrykke adenovirus for å fjerne markøren i kassetten, bare MS2 sekvenser og et enkelt lox-p nettsted på subtelomere 15q. Uttrykk for MS2-merket TERRA transkripsjoner fra Tel15q kontrolleres av RT-qPCR. Endelig MS2-GFP fusion protein er uttrykt i TERRA-MS2 kloner via retroviral infeksjon for å visualisere MS2-TERRA transkripsjoner av fluorescens mikroskopi. TERRA utskrifter kan lett oppdaget av RNA-fisk og live-celle bildevisning telomeric gjenta-spesifikke sonder1,2,15,23. Disse gir viktig informasjon om lokalisering av den totale befolkningen i TERRA molekyler enkeltcelle oppløsning. Generering av kloner som inneholder MS2 sekvenser på en enkelt subtelomere kan forskere til å studere dynamikken i enkelt-telomere TERRA utskrifter i levende celler, som bidrar til å definere funksjonen og virkningsmekanismer av TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en metode for å generere menneskelige kreft cellen kloner som inneholder MS2 sekvenser integrert i subtelomere 15q. Bruker disse kloner, er MS2-merket TERRA molekylene transkribert fra subtelomere 15q oppdaget av fluorescens mikroskopi av co uttrykk for en MS2-GFP fusion protein. Dette gir forskere til å studere dynamikken i TERRA uttrykt fra en enkelt telomere i levende celler21. I denne protokollen velges TERRA-MS2 kloner i AGS celle linjen som representerer e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til ansatte i avansert tenkelig anlegget i CIBIO ved Universitetet i Trento og BioOptics lys mikroskopi anlegget på Max F. Perutz Laboratories (MFPL) i Wien. Forskningen førte til disse resultatene har fått støtte fra Mahlke-SS-Obermann-Stiftung og EUs syvende rammeprogram for forskning og teknologiutvikling demonstrasjon grant avtalen ingen 609431 til EC. EC støttes av en Rita Levi Montalcini fellowship fra det italienske Forsvarsdepartementet utdanning universitet og forskning (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
