Generation av Cancer Cell kloner att visualisera Telomeric Repeat-innehållande RNA TERRA uttryckt från en enda telomeren i levande celler
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera cancer cell kloner som innehåller en MS2 sekvens tagg på en enda subtelomere. Detta tillvägagångssätt, att förlita sig på MS2-GFP systemet, möjliggör visualisering av endogena avskrifter av telomeric repeat-innehållande RNA (TERRA) uttryckt från en enda telomeren i levande celler.
Abstract
Telomerer transkriberas, ger upphov till telomeric repeat-innehållande länge icke-kodande RNAs (TERRA), som har föreslagits att spela viktiga roller i telomeren biologi, inklusive Heterokromatin bildandet och telomerens längd homeostas. Senaste resultaten avslöjade att TERRA molekyler också interagera med interna kromosomala regioner att reglera genuttrycket i mus embryonala stamceller (ES) används. I linje med detta bevis, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har visat att endast en delmängd av TERRA lokalisera avskrifter i kromosom ändar. En bättre förståelse av dynamiken i TERRA molekyler kommer att hjälpa till att definiera deras funktion och verkningsmekanismer. Här, beskriver vi en metod för att märka och visualisera singel-telomer TERRA avskrifter i cancerceller med hjälp av MS2-GFP-systemet. I detta syfte presenterar vi ett protokoll för att generera stabil kloner, använda AGS mänskliga magen cancer cell linjen, som innehåller MS2 sekvenser är integrerade på ett enda subtelomere. Transkription av TERRA från MS2-taggade telomeren resulterar i uttrycket av MS2-taggade TERRA molekyler som visualiseras av live-cell fluorescensmikroskopi vid samtidig uttryck för en MS2 RNA-bindande protein smält till GFP (MS2-GFP). Denna metod gör det möjligt för forskare att studera dynamiken i singel-telomer TERRA molekyler i cancerceller, och det kan tillämpas på andra cellinjer.
Introduction
Långa icke-kodande RNA TERRA är transkriberas från den subtelomeric regionen kromosomer och dess transkription fortsätter mot kromosom ändarna, avslutas inom den telomeric upprepa tarmkanalen1,2. Av denna anledning, TERRA avskrifter består av subtelomeric-derived sekvenser i sin 5′-änden och avsluta med telomeric repetitioner (UUAGGG hos ryggradsdjur)3. Viktiga roller har föreslagits för TERRA, inklusive Heterokromatin bildande på telomererna4,5, DNA-replikering6, främja homolog rekombination bland kromosom avslutas7,8 , 9, reglera telomeren struktur10och telomerens längd homeostas2,11,12,13. Dessutom interagerar TERRA avskrifter med talrika extratelomeric webbplatser att reglera utbredd genuttryck i mus embryonala stamceller (ES) celler14. I linje med dessa bevis, RNA fluorescens i situ hybridisering (RNA-fisk) analyser har visat att endast en delmängd av TERRA avskrifter lokalisera telomerer1,2,15. TERRA har dessutom rapporterats till formuläret nukleära aggregat lokalisera på X och Y kromosomerna i mus celler2,16. Dessa fynd tyder på att TERRA avskrifter genomgår komplexa dynamiken inom kärnan. Förstå dynamiken i TERRA molekyler kommer att hjälpa till att definiera deras funktion och verkningsmekanismer.
MS2-GFP systemet har använts att visualisera RNA-molekyler i levande celler från olika organismer17,18. Detta system har använts tidigare tagga och visualisera singel-telomer TERRA molekyler i S. cerevisiae12,19. Med detta system, visades det nyligen att jäst TERRA avskrifter lokalisera inom cytoplasman under post-diauxic Skift, vilket tyder på att TERRA kan utöva extranuclear funktioner20. Vi har nyligen använt MS2-GFP systemet för att studera singel-telomer TERRA avskrifter i cancer celler21. I detta syfte vi anställd den CRISPR/Cas9 genom redigerande redskap att integrera MS2 sekvenser på en enda telomeren (telomeren 15q, nedan kallad Tel15q) och erhållna kloner att uttrycka MS2-taggade endogena Tel15q TERRA (TERRA-MS2 kloner). Samtidig uttryck för ett GFP-smält MS2 RNA-bindande protein (MS2-GFP) som känner igen och binder MS2 RNA sekvenser möjliggör visualisering av singel-telomer TERRA avskrifter i levande celler21. Syftet med protokollet illustreras här är att beskriva i detalj de steg som krävs för generering av TERRA-MS2 kloner.
För att generera TERRA-MS2 kloner, en MS2 kassett är integrerad i regionen subtelomeric i telomeren 15q, nedströms webbplatsen TERRA promotor regionen och transkription start. MS2 kassetten innehåller en neomycin motstånd gen flankerad av lox-p platser, och dess integration på subtelomere 15q utförs med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet22. Efter transfection av den MS2 kassett, enda kloner är markerade och subtelomeric integration av kassetten är verifierad av PCR, DNA ordningsföljd och Southern blot. Positiva kloner är infekterad med en Cre-uttryckande adenovirus för att ta bort markeringen markören i kassett, lämnar bara MS2 sekvenser och en enda lox-p-plats på subtelomere 15q. Uttryck för MS2-taggade TERRA avskrifter från Tel15q är verifierad av RT-qPCR. Slutligen, MS2-GFP fusion proteinet uttrycks i TERRA-MS2 kloner via retrovirala infektion för att visualisera MS2-TERRA avskrifter av fluorescensmikroskopi. TERRA avskrifter kan lätt upptäckas av RNA-fisk och live-cell bildåtergivning med telomeric repeat-specifika sonder1,2,15,23. Dessa metoder ger viktig information på localizationen av den sammanlagda befolkningen av TERRA molekyler i enskild cell upplösning. Generering av kloner som innehåller MS2 sekvenser på en enda subtelomere gör att forskare att studera dynamiken i singel-telomer TERRA avskrifter i levande celler, som kommer att hjälpa till att definiera funktion och verkningsmekanismer av TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel presenterar vi en metod för att generera mänskliga cancer cell kloner som innehåller MS2 sekvenser integrerade inom subtelomere 15q. Använder dessa kloner, upptäcks MS2-taggade TERRA molekylerna transkriberas från subtelomere 15q av fluorescensmikroskopi av samtidig uttryck av en MS2-GFP fusionsprotein. Denna metod gör det möjligt för forskare att studera dynamiken i TERRA uttryckt från en enda telomeren i levande celler21. I detta protokoll, är TERRA-MS2 kloner markerad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för den avancerade imaging anläggningen i CIBIO vid universitetet i Trento och BioOptics ljus Microscopy anläggningen på Max F. Perutz Laboratories (MFPL) i Wien personal. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från den Mahlke-Obermann Stiftung och EU: s sjunde ramprogram för forskning, teknisk utveckling och demonstration under bidragsavtalet ingen 609431 till EG. EG stöds av en Rita Levi Montalcini stipendium från det italienska ministeriet för utbildning och forskning (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
