Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Published: January 17, 2019

doi:

Laura Avogaro, Claudio Oss Pegorar, Nicole Bettin², Emilio Cusanelli

¹Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology – CIBIO,University of Trento, ²Department of Life Sciences,University of Trieste

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Krebs Zellklonen mit einem MS2 Sequenz Beschriftung auf einer einzigen Produktlinie zu generieren. Dieser Ansatz, unter Berufung auf das MS2-GFP-System ermöglicht die Visualisierung der endogenen Abschriften der telomeric Repeat-haltigen RNA (TERRA) von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt.

Abstract

Telomere sind transkribiert telomeric Repeat-haltigen lange forensisches RNAs (TERRA), verursachend, die sind vorgeschlagen worden, eine wichtige Rolle in der Telomere Biologie, einschließlich Heterochromatin Bildung und Telomere Länge Homöostase spielen. Neue Erkenntnissen zufolge TERRA Moleküle auch mit inneren chromosomalen Regionen zur Regulierung der Genexpression in Mauszellen embryonaler Stammzellen (ES) interagieren. Im Einklang mit dieser Beweis RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge von TERRA Abschriften an Chromosomenenden lokalisieren. Ein besseres Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA hilft, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren. Hier beschreiben wir eine Methode zum Beschriften und Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebszellen mit dem MS2-GFP-System zu visualisieren. Zu diesem Zweck präsentieren wir ein Protokoll, um stabile Klone zu erzeugen mit Hilfe der AGS menschlichen Magen Krebs Zell-Linie mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie integriert. Transkription von TERRA von MS2-Tags Telomere ergibt sich in der Expression von MS2-Tags TERRA-Moleküle, die durch live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie auf Co Ausdruck ein MS2-RNA-bindende Protein mit GFP (MS2-GFP) verschmolzen visualisiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik des Single-Telomere TERRA Moleküle in Krebszellen zu studieren, und es kann auf andere Zelllinien angewendet werden.

Introduction

Die lange nichtcodierender RNA-TERRA ist aus der Region subtelomerischen Chromosomen transkribiert und seine Transkription verläuft in Richtung der Chromosomenenden, beendet in der telomeric repeat Trakt¹^,². Aus diesem Grund TERRA Abschriften bestehen aus subtelomeric stammenden Sequenzen an ihrem 5′-Ende und beenden mit telomeric Wiederholungen (UUAGGG bei Wirbeltieren)³. Wichtige Rollen vorgeschlagen worden für TERRA, einschließlich Heterochromatin Bildung Telomere⁴^,⁵, DNA-Replikation⁶, Förderung der homologen Rekombination zwischen Chromosom⁷^,⁸ endet ^, ⁹, Regulierung der Telomere Struktur¹⁰und Telomere Länge Homöostase²^,¹¹^,¹²^,¹³. Darüber hinaus interagieren TERRA Transkripte mit zahlreichen Extratelomeric Websites, weit verbreitete Genexpression in Maus embryonaler Stammzellen (ES) Zellen¹⁴zu regulieren. Im Einklang mit diesen Beweis, RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge der TERRA Transkripte lokalisieren Telomere¹^,²^,¹⁵. Darüber hinaus wurde TERRA Form nuklearen Aggregate Lokalisierung auf der X und Y Chromosomen in Maus Zellen²^,¹⁶berichtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass TERRA Transkripte komplexe Dynamik innerhalb des Zellkerns zu unterziehen. Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA wird dazu beitragen, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren.

Das MS2-GFP-System hat verbreitet, RNA-Moleküle in lebenden Zellen aus verschiedenen Organismen¹⁷^,¹⁸zu visualisieren. Dieses System hat früher zu markieren und zu visualisieren Single-Telomere TERRA Moleküle in S. Cerevisiae¹²^,¹⁹. Mit diesem System vor kurzem zeigte sich, dass Hefe TERRA Transkripte lokalisieren innerhalb des Zytoplasmas während der Phase der Post-Diauxic-Schicht darauf hindeutet, dass TERRA extranuclear Funktionen²⁰ausüben kann. Wir haben vor kurzem MS2-GFP-System verwendet, um Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebs Zellen²¹zu studieren. Zu diesem Zweck wir beschäftigt die CRISPR/Cas9-Genom-editing-Tool, MS2 Sequenzen an ein einzelnes Telomer (Telomere 15q, im folgenden Tel15q) zu integrieren und erhalten Klone MS2-Tags endogenen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 Klone) zum Ausdruck zu bringen. Co Ausdruck ein GLP-verschmolzen MS2-RNA-bindende Protein (MS2-GFP), das erkennt und bindet MS2-RNA Sequenzen ermöglicht Visualisierung von Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen²¹. Das hier abgebildete Protokoll soll für die Generation von TERRA-MS2 Klonen erforderlichen Schritte im Detail zu beschreiben.

Um TERRA-MS2 Klone zu erzeugen, ist eine MS2 Kassette innerhalb der subtelomerischen Region der Telomere 15q, integriert der TERRA Promotor Region und Transkription Startsite nachgeschaltet. Die MS2-Kassette enthält eine Neomycin-Resistenz-Gen von Lox-p Seiten flankiert, und seine Integration in die Produktlinie 15q erfolgt über CRISPR/Cas9 System²². Nach Transfektion von der MS2 Kassette, einzelnen Klone ausgewählt sind und subtelomerischen Integration der Kassette wird verifiziert durch PCR, DNA Sequenzierung und Southern blot. Positive Klone sind mit einem Cre exprimierenden Adenovirus infiziert, um die Auswahlmarkierung in der Kassette entfernen nur MS2 Sequenzen und eine einzelne Lox-p vor Ort bei der Produktlinie 15q verlassen. Ausdruck der MS2-Tags TERRA Abschriften von Tel15q wird von RT-qPCR überprüft. Zu guter Letzt drückt sich die MS2-GFP Fusionsprotein in TERRA-MS2 Klone über retroviralen Infektion um MS2-TERRA Transkripte von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. TERRA Transkripte von RNA-Fisch leicht nachweisbar und live Cell Imaging mit telomeric Repeat-spezifische Sonden¹^,²^,¹⁵^,²³. Diese Ansätze liefern wichtige Informationen über die Lokalisation der Gesamtbevölkerung von TERRA Moleküle in einzelne Zelle Auflösung. Die Generation der Klone mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie ermöglicht es Forscher studieren die Dynamik des Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen, die helfen die Funktion und die Mechanismen der Wirkung von TERRA zu definieren.

Protocol

1. Auswahl von Neomycin resistente Klone Wachsen Sie AGS-Zellen in Ham es F-12_K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium) und Streptomycin (0,2 µg pro mL Medium) bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Zellen mit einem 50-60 % Zusammenfluss mit dem SgRNA/Cas9 mit dem Ausdruck Vektor und der MS2-Kassette auf eine 01:10 transfizieren Molverhältnis21.Hinweis: In einer parallelen Programmierung überprüfen …

Representative Results

Abbildung 1 stellt einen Überblick über die experimentelle Strategie. Die wichtigsten Schritte des Protokolls und einer indikativen Zeitlinie zur Erzeugung von TERRA-MS2 Klone in AGS Zellen werden (Abb. 1A) angezeigt. Am 1. Tag sind mehrere Brunnen von einem 6-well-Platte mit der MS2 Kassette und SgRNA/Cas9 zum Ausdruck zu bringen (siehe Abbildung 1B)…

Discussion

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Krebserkrankungen Zellklonen mit MS2 Sequenzen innerhalb Produktlinie 15q integriert zu generieren. Diese Klone verwenden, werden die MS2-Tags TERRA-Moleküle aus der Produktlinie 15q transkribiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie von Co Ausdruck ein MS2-GFP Fusionsprotein erkannt. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik der TERRA von einem einzigen ausgedrückt zu studieren Telomere in lebenden Zellen²¹. In diesem Protokoll werde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar für das Personal der die erweiterte Bildgebung von CIBIO an der Universität Trient und BioOptics Licht Mikroskopie Facility bei Max F. Perutz Laboratories (MFPL) in Wien. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell von der Mahlke-Obermann-Stiftung und der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration unter Finanzhilfevereinbarung keine 609431 EG EG wird unterstützt durch ein Rita Levi Montalcini-Stipendium vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung (MIUR).

Materials

AGS cells	–	–	Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X	GIBCO	21127022	Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine	CORNING	MT25005CI	Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution	CORNING	30-002-CI	Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	Component of cell culturing medium
DMEM 1X	GIBCO	21068028	culturing medium for phoenix cell
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	used in phoenix cell transfection
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl	Sigma Aldrich	P9333	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X	CORNING	59430C	used in cell split
DPBS 1X	GIBCO	14190250	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate	Formedium	G4185	selection drug for
Gelatin solution Bioreagent	Sigma Aldrich	G1393	cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base	Fisher BioReagents	10376743	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS	Sigma Aldrich	71729	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K	Thermo Fisher	AM2546	Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A	Thermo Fisher	12091021	RNA degradation during DNA extraction
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	DNA gel preparation
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol	Fisher BioReagents	BP28184	DNA precipitation
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	71196	Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system	Promega	A9282	Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol	AMBION	15596018	Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I	THERMO SCIENTIFIC	89836	degradation of genomic DNA from RNA
dNTPs mix	Invitrogen	10297018	used in RT and PCR reactions
DTT	Invitrogen	707265ML	used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate	Sigma Aldrich	D5758	used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock	Thermo Fisher	EO0381	RNase inhibitor
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	preparation of RNA gel
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen	18080-093	Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant)	Thermo Scientific	EP0501	PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR BIOSYSTEMS	PB 20.14	qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887	used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom	Ibidi	81158	used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).