Produktion af ekstracellulære Matrix fibre via hellige hule Fiber membran cellekultur
Summary
Målet med denne protokol er produktion af hele ekstracellulære matrix fibre indskyde nemlig sår reparation, som er egnet til præklinisk evaluering som en del af en regenerativ stillads implantat. Disse fibre er produceret af kulturen i fibroblaster på hule fibre membraner og udvindes ved opløsning af membraner.
Abstract
Manipuleret stilladser afledt af ekstracellulære matrix (ECM) har drevet betydelig interesse i medicin for deres potentiale i fremskynde sår lukning og healing. Udvinding af ekstracellulære matrix fra fibrogenic celle kulturer i vitro har potentiale for generation af ECM fra menneskelige- og potentielt patient-specifikke cellelinjer, minimere forekomsten af xenogene epitoper, som har hindret den kliniske succes af nogle eksisterende ECM produkter. En betydelig udfordring i in vitro- produktion af ECM egnet til implantation er at ECM produktion af cellekultur er typisk relativt lavt udbytte. I dette arbejde, er protokoller beskrevet til produktion af ECM af celler kulturperler inden for hellige hule fiber membran stilladser. Hule fibre membraner er kulturperler med fibroblast cellelinjer i en konventionel celle medium og opløst efter cellekultur at give kontinuerlig tråde af ECM. De resulterende ECM fibre fremstillet af denne metode kan decellularized og frysetørret, gør dem egnet til opbevaring og implantation.
Introduction
Implantable kirurgisk stilladser er et armatur af sår reparation, med over en million syntetisk polymer masker implanteret på verdensplan hvert år for bugvæggen reparation alene1. Men efter implantation syntetiske materialer polymerer traditionelt anvendes i fremstilling af disse stilladser har tendens til at fremprovokere en udenlandsk organ svar, resulterer i inflammation skadelige til funktionen af implantatet og ardannelse i væv2 . Yderligere, da de fremherskende syntetiske mesh materialer (dvs., polypropylen) ikke er mærkbart ombygget af kroppen, de er generelt gælder for væv hvor ardannelse kan tolereres, begrænse deres kliniske anvendelighed mod behandling af væv med højere-ordens funktion såsom muskel. Mens der er mange kirurgiske mesh produkter, der er blevet anvendt med kliniske succes, seneste producent, der minder om af syntetisk kirurgiske masker og komplikationer fra interspecies væv implantater fremhæve betydningen af maksimering af implantat biokompatibilitet, at spørge FDA til at stramme reglerne på kirurgisk mesh producenter3,4. Implantation af stilladser afledt af patienternes egne væv reducerer denne immunrespons, men kan resultere i betydelige donor-site sygelighed5. Ekstracellulær matrix (ECM) stilladser fremstillet in vitro- er et muligt alternativ, som decellularized ECM stilladser udstiller fremragende biokompatibilitet, især i tilfælde af autolog ECM implantater6.
På grund af de begrænsede mængder af patient væv til at høste til autolog implantation og risikoen for at hæmme funktion på webstedet donor, evnen til at producere ECM scaffolds in vitro- fra kulturen af human cellelinjer eller, hvis det er muligt, en patient egne celler er et attraktivt alternativ. De primære udfordringer i fremstilling af betydelige mængder af ECM i vitro er binding af disse vanskeligt at fange molekyler. I tidligere arbejde, vi har bevist, at ECM kan være fremstillet ved dyrkning af ECM-secernerende fibroblaster i opoffrende polymere skum, der er opløst efter perioden kultur til udbytte ECM, som kan være decellularized for implantation7, 8,9,10. ECM fremstillet i skum tendens til at vedtage den interne arkitektur af skum, hule fibre membraner (HFMs) blev undersøgt som en opoffrende stillads til produktion af tråde af ECM. Beskrevet heri er metoder opgave for lab skala fremstilling af cellemembraner kultur kvalitet hule fibre og udvinding af bulk ekstracellulære matrix fibre fra den samme efter en periode med fibroblast kultur. Denne statiske kultur tilgang er let adoptere af laboratorier som indeholder standard pattedyr celle kultur udstyr. ECM produceret af denne tilgang kunne anvendes mod en række kliniske applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De processer, der er beskrevet aktiverer produktionen af bulk ECM biomaterialer in vitro- ved hjælp af hule fibre membraner støbt af en tør-jet våde spinning system giver mulighed for billig bulk produktionen af membraner samt standard celle kultur udstyr. Mens membraner fabrikeret i denne protokol er beregnet til brug i cellekultur, kan systemet beskrevet også være tilpasset til fremstilling af membraner til adskillelse formål, med pore distribution og hule fibre størrelsesdimensioner afstemmelige af va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af det nationale Institut for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme af National Institutes of Health under award nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt den Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
