Produktion av extracellulärmatrix fibrer via uppoffrande ihålig Fiber membran cellkultur
Summary
Målet med detta protokoll är produktionen av hela extracellulära matrix fibrer måltavlan för såret reparation som är lämpliga för preklinisk utvärdering som en del av en regenerativ byggnadsställning implantatet. Dessa fibrer är producerad av kulturen av fibroblaster på ihålig fiber membran och utvinns av upplösningen av membranen.
Abstract
Bakåtkompilerade ställningar härrör från extracellulär matrix (ECM) har driven betydande intresse i medicin för sin potential påskynda sår stängning och helande. Utvinning av extracellulär matrix från fibrogenic cell kulturer i vitro har potential för generering av ECM från mänskliga- och potentiellt patientspecifika cellinjer, minimera förekomsten av xenogena epitoper som har hindrat den kliniska framgången för vissa befintliga ECM-produkter. En stor utmaning i in vitro- produktion av ECM lämpliga för implantation är att ECM produktion av cellodling är vanligtvis relativt låg avkastning. I detta arbete beskrivs protokoll för produktion av ECM av celler odlade inom uppoffrande ihålig fiber membran ställningar. Ihålig fiber membran är odlade med fibroblast cellinjer i konventionella cell medium och upplöstes efter cellkultur att ge kontinuerlig trådar av ECM. Den resulterande ECM-fibrer som framställs med denna metod kan cell-lösa och frystorkade, gör den lämplig för lagring och implantation.
Introduction
Implanterbara kirurgiska ställningar är en fixtur av såret reparation, med över en miljon syntetisk polymer maskor implanteras i världen varje år för bukväggen reparation ensam1. Men efter implantation syntetmaterial polymererna traditionellt används vid tillverkning av dessa ställningar tenderar att provocera en främmande kropp som svar resulterar i inflammation skadliga till funktionen av implantatet och ärrbildning i vävnad2 . Ytterligare, eftersom de dominerande syntetiska nät material (dvs polypropen) inte är märkbart remodeled av kroppen, de är allmänt tillämpliga på vävnader där ärrbildning kan tolereras, vilket begränsar deras kliniska nyttan mot behandling av vävnader med högre ordningens funktion såsom muskel. Medan det finns många kirurgiska mesh-produkter som har tillämpats med klinisk framgång, senaste tillverkaren påminner om av syntetiska kirurgiska maskor och komplikationer från SAR vävnad implantat betona vikten av att maximera implantat biokompatibilitet, föranledde FDA att skärpa bestämmelserna om kirurgiska mesh tillverkare3,4. Implantation av ställningar som härrör från patienternas egna vävnader minskar detta immunsvar, men kan resultera i betydande givare-site sjuklighet5. Extracellulär matrix (ECM) ställningar som producerats in vitro- är ett möjligt alternativ, som cell-lösa ECM ställningar uppvisar utmärkt biokompatibilitet, särskilt när det gäller autolog ECM implantat6.
På grund av den begränsade tillgången av patientens vävnad att skörda för autolog implantation och risken för hindrar funktionen på webbplatsen givare, förmågan att producera ECM ställningar i vitro från kulturen av mänskliga cellinjer eller, om möjligt, en patients egna celler är ett attraktivt alternativ. De viktigaste utmaningarna för tillverkning av betydande mängder av ECM i vitro är beslagtagande av dessa svårt-att-capture molekyler. I tidigare arbete, vi har visat att ECM kan produceras av odlingsskålar ECM-utsöndrar fibroblaster i uppoffrande polymera skum som löses efter perioden kultur till kapacitet ECM som kan vara decellularized för implantation7, 8,9,10. Som ECM som produceras i skum tenderar att anta interna arkitekturen av skum, ihålig fiber membran (HFMs) undersöktes som en uppoffrande byggnadsställning för produktion av trådar av ECM. Beskrivs häri metoder i uppdrag att för lab skala tillverkning av cellmembranen kultur kvalitet ihålig fiber och utvinning av bulk extracellulärmatrix fibrer från samma efter en period av fibroblast kultur. Denna statiska kultur strategi är lätt adoptable av laboratorier som innehåller standard däggdjursceller kultur utrustning. ECM produceras av detta synsätt skulle kunna tillämpas mot en mängd kliniska tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
De processer som beskrivs möjliggör produktion av bulk ECM biomaterial i vitro med ihålig fiber membran kastades av en torr-jet våta spinning-system som möjliggör billiga huvuddelen produktion av membran samt standard cell kultur utrustning. Medan de membran som är fabricerade i detta protokoll är avsedda för användning i cellkultur, kan det beskrivna systemet även anpassas för produktion av membran för separation, med por storlek distribution och ihålig fiber mått avstämbara av varierande spinnd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala systemet och hudsjukdomar av det nationella Institutes of Health award nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
