عزل ووصف البشرية المستمدة من الحبل السري الخلايا الجذعية الوسيطة من الخدج والرضع الناضجين
Summary
الحبل السري البشري (UC) يمكن الحصول عليها خلال فترة ما حول الولادة نتيجة للأجل قبل الأوان، ومن بوستتيرم التسليم. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.
Abstract
إمكانيات علاجية كبيرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وجذب اهتمام متزايد في مجال الطب الحيوي. MSCs هي أصلاً معزولة تتسم من نخاع العظم (بي أم)، ثم اكتسبت من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان والملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، والحبل السري (UC). MSCs عدد سكان خلية غير متجانسة مع القدرة على (1) التمسك بالبلاستيك في ظروف الثقافة القياسية، علامة (2) سطح التعبير عن CD73+/CD90+/CD105+/CD45/CD34––/CD14/CD19– تعمل/HLA-DR– –، والتمايز تريلينيجي (3) في adipocytes، أوستيوسيتيس، وتشوندروسيتيس، التي حددها “المجتمع الدولي” حاليا للعلاج الخلوي (إيست). على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر استخداماً من MSCs، طبيعة الغازية تطلع BM أخلاقيا يحد إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، الجنين MSCs التي تم الحصول عليها من جامعة كاليفورنيا بمزايا مثل انتشار قوي وقدرة التمايز. هناك لا قلق أخلاقية لأخذ العينات من جامعة كاليفورنيا، كما أنها تعتبر عادة النفايات الطبية. تفرد الإنسان يبدأ مع استمرار نمو تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل ويبقى المتزايد حتى وصلت إلى 50-60 سم في الطول، وأنها يمكن أن تكون معزولة أثناء فترة أسرة الوليد تسليم. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، وقد استخدمنا MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع وألقى في الإعمار الحملية المختلفة. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي أصلاً معزولة وتتميز من نخاع العظم (بي أم)1،2 ولكن يمكن أيضا الحصول على مجموعة متنوعة من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان وملحقات الجنين 3-MSCs هي المعترف بها كمحتوى خلية غير متجانسة التي يمكن أن تنتشر وتفرق في adipocytes وأوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، MSCs تمتلك القدرة على الهجرة إلى مواقع الإصابة وقمعها وتعدل الاستجابات المناعية، وإعادة تشكيلها، وإصلاح الضرر. حاليا، MSCs من مصادر مختلفة وقد اجتذبت اهتمام متزايد كمصدر للخلايا العلاج ضد عدد من الأمراض المستعصية، بما في ذلك الاختلاس – مقابل – المضيف المرض واحتشاء عضلة القلب، واحتشاء دماغي4،5 .
على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر تميز جيدا من MSCs، اختزاع تطلع BM أخلاقيا يحد من إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، MSCs الأجنة التي تم الحصول عليها من الملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، ويكون الحبل السري (UC) المزايا بما في ذلك الشواغل الأخلاقية أقل فيما يتعلق بانتشار أخذ العينات وقوية وتمايز القدرات6 , 7-بين الجنين الملاحق التي عادة ما يتم إهمالها كالنفايات الطبية، UCB وتفرد تعتبر جهازا للجنين، في حين تعتبر المشيمة فيتوماتيرنال. وبالإضافة إلى ذلك، تحتاج المشيمة و UCB أخذ عينات منها وجمعها في هذه اللحظة الدقيقة من تسليم الأطفال حديثي الولادة، بينما المشيمة وتفرد يمكن جمعها ومعالجتها بعد الولادة حديثي الولادة. تبعاً لذلك، تفرد مصدرا واعداً من لجنة السلامة البحرية لخلية العلاج8،9.
تفرد الإنسان يبدأ تطوير مع التوسع التدريجي في تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، ويمكن أن تكون معزولة خلال كامل فترة الوليد تسليم10. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، ونحن استخدام MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع في مختلف الإعمار الحملية11،12. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية عزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن أن تكون معزولة من مجموعة متنوعة من الأنسجة MSCs السكان غير متجانسة من الخلايا التي تفعل إكسبرس ليس كل العلامات المظهرية نفس. هنا، نحن المبينة بروتوكول أن أدلة جمع والتشريح من جامعة كاليفورنيا من الرضع الخدج والمدة ويمكن عزلة وثقافة UC-MSCs. وفي أعقاب هذا البروتوكول، نحن بنجاح معزولة UC-MSCs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمعونة عن Scientific Research (C) (منح رقم: 25461644) والعلماء الشباب (ب) (منح أرقام: 15 ك 19614، 26860845، 17 ك 16298) من كاكينهي JSPS.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
