Summary

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Published: January 26, 2019
doi:

Summary

Menselijke navelstreng (UC) kan worden verkregen in de perinatale periode als gevolg van premature, termijn en postterm levering. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-afgeleide mesenchymale stamcellen (UC-MSCs) uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Abstract

Mesenchymale stamcellen (MSCs) hebben aanzienlijke therapeutische mogelijkheden en toenemende belangstelling in de biomedische veld. MSCs zijn oorspronkelijk geïsoleerd en gekenmerkt uit beenmerg (BM), dan verworven weefsel met inbegrip van vetweefsel, synovia, huid, tandmerg en foetale aanhangsels zoals de placenta, navelstrengbloed (UCB), en de navelstreng (UC). MSCs zijn een heterogene celpopulatie met de capaciteit voor (1) naleving van kunststof in standaard kweekomstandigheden, (2) oppervlakte marker uitdrukking van CD73+/CD90+/CD105+/CD45/CD34/CD14/CD19 /HLA-DR fenotypen, en (3) trilineage differentiatie in adipocytes, osteocytes en chondrocyten, zoals dat momenteel gedefinieerd door de International Society voor cellulaire therapie (ISCT). Hoewel BM de wijdst gebruikte bron van MSCs is, beperkt het invasieve karakter van BM aspiratie ethisch zijn toegankelijkheid. Capaciteit van de proliferatie en differentiatie van MSCs BM verkregen in het algemeen dalen met de leeftijd van de donor. Daarentegen hebben de foetale MSCs UC verkregen voordelen zoals krachtige proliferatie en differentiatie capaciteit. Er is geen ethische bezorgdheid voor UC bemonstering, zoals het meestal wordt beschouwd als medisch afval. Menselijke UC begint te ontwikkelen met de aanhoudende groei van het vruchtwater spouw op 4-8 weken van de dracht en houdt tot het bereiken van de 50-60 cm in de lengte groeien, en gedurende de hele pasgeboren leveringsperiode geïsoleerd kan worden. Om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van hardnekkige ziekten, hebben we de UC-afgeleide MSCs (UC-MSCs) van zuigelingen geleverd op verschillende zwangerschapsduur leeftijd gebruikt. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-MSCs uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Introduction

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn oorspronkelijk geïsoleerd en gekenmerkt uit beenmerg (BM)1,2 , maar kan ook worden verkregen bij een breed scala aan weefsels, met inbegrip van vetweefsel, synovia, huid, tandmerg en foetale aanhangsels 3. MSCs worden erkend als een heterogene celpopulatie die kan vermenigvuldigen en differentiëren in adipocytes, osteocytes en chondrocyten. Daarnaast MSCs beschikken over het vermogen om te migreren naar plaatsen van verwonding, onderdrukken en moduleren immuunresponsen, verbouwen en herstellen van schade. Op dit moment hebben MSCs uit verschillende bronnen groeiende belangstelling aangetrokken als een bron voor celtherapie tegen een aantal hardnekkige ziekten, inclusief graft – versus-klauwzeer host, myocardinfarct en cerebrale infarct4,5 .

Hoewel BM de meest goed gekarakteriseerd bron van MSCs is, beperkt de invasiviteit van BM aspiratie ethisch zijn toegankelijkheid. Capaciteit van de proliferatie en differentiatie van MSCs BM verkregen in het algemeen dalen met de leeftijd van de donor. In tegenstelling, foetale MSCs verkregen foetale aanhangsels zoals de placenta, navelstrengbloed (UCB), en navelstreng (UC) hebben voordelen, waaronder minder ethische bezwaren met betrekking tot bemonstering en robuuste proliferatie en differentiatie capaciteit6 , 7. onder foetale aanhangsels die zijn meestal weggegooid als medisch afval, UCB en UC worden beschouwd als een foetale orgel, terwijl de placenta wordt beschouwd als fetomaternal. Bovendien, moeten placenta en UCB worden bemonsterd en verzameld op het exacte moment van pasgeboren levering, overwegende dat de placenta en UC kan worden verzameld en na de pasgeboren levering verwerkt. Dienovereenkomstig, UC is een veelbelovende MSC-bron voor cel therapie8,9.

Menselijke UC begint te ontwikkelen met geleidelijke uitbreiding van het vruchtwater holte op 4-8 weken van de dracht, blijft tot 50-60 cm in de lengte groeien, en kan worden geïsoleerd gedurende de gehele looptijd van pasgeboren levering10. We gebruiken om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van hardnekkige ziekten, UC-afgeleide MSCs (UC-MSCs) van zuigelingen op verschillende zwangerschapsduur leeftijd11,12afgeleverd. In dit protocol beschrijven we hoe u kunt isoleren en karakteriseren van UC-MSCs uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Protocol

Het gebruik van menselijke specimens voor deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Kobe University Graduate School of Medicine (goedkeuring nr. 1370 en 1694) en uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtsnoeren. 1. isolatie en de cultuur van UC-MSCs Opmerking: UC-MSCs werden met succes geïsoleerd, gekweekt, en uitgebreide (meer dan passage nummer 4) van meer dan 200 UCs onderworpen aan dit protocol. Onder meer dan 200 …

Representative Results

De procedures uit UC collectie aan MSC cultuur worden samengevat in Figuur 1. UC van ongeveer 5-10 cm in lengte kan worden verzameld van alle pasgeborenen geleverd door keizersnede. UC begint te ontwikkelen op 4-8 weken van de dracht en blijft groeien tot 50-60 cm in lengte, zoals weergegeven in Figuur 2. Er zijn twee slagaders (A), één ader (V), snoer voering (CL) en Wharton van Jelly (WJ) in UC, zoals afgebeeld in <strong cla…

Discussion

MSCs kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan weefsels en heterogene populatie vormen van cellen die niet alle express de dezelfde fenotypische markers doen. We beschreven hier, een protocol dat het verzamelen en de dissectie van UC van vroeggeboorte en termijn zuigelingen begeleidt en maakt isolatie en cultuur van UC-MSCs. Naar aanleiding van dit protocol, hebben we met succes geïsoleerd UC-MSCs die voldoen aan de ISCT criteria19 uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de drach…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de Grants-in-Aid voor Scientific Research (C) (verlenen van nummer: 25461644) en jonge wetenschappers (B) (verlenen van nummers: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) van JSPS KAKENHI.

Materials

50mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Play Video

Cite This Article
Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

View Video