Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff
Summary
Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.
Abstract
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) haben erhebliches therapeutische Potenzial und zunehmendes Interesse im Bereich Biomedizin zu gewinnen. MSCs sind ursprünglich isoliert und charakterisiert, die aus dem Knochenmark (BM), dann gewonnenen Gewebe, wie Fettgewebe, Synovialis, Haut, Zahnpulpa und fetalen Anhängseln wie Plazenta, Nabelschnurblut (UCB) und Nabelschnur (UC). MSCs sind eine heterogene Zellpopulation mit einer Kapazität für (1) die Einhaltung Kunststoff in standard Kulturbedingungen, (2) Oberfläche Marker Ausdruck CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14–/CD19 –/HLA-DR– Phänotypen, und (3) Trilineage Differenzierung in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten, wie Sie derzeit von der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie (ISCT) definiert. Obwohl BM die am weitesten verbreitete Quelle der MSCs ist, schränkt die invasive Art des Strebens BM ethisch seiner Zugänglichkeit. Proliferation und Differenzierung Kapazität von MSCs von BM erhalten in der Regel nimmt mit dem Alter des Spenders. Im Gegensatz dazu haben fetalen MSCs UC gewonnenen Vorteile wie kräftige Proliferation und Differenzierung Kapazität. Da es in der Regel als medizinische Abfälle gilt, gibt es keine ethischen Bedenken für UC Probenahme. Menschlichen UC mit anhaltenden Wachstum des Fruchtwassers Hohlraums bei 4 bis 8 Wochen der Schwangerschaft zu entwickeln beginnt und hält bis zu 50-60 cm in der Länge wachsen, und es kann während der gesamten Neugeborenen Lieferzeit isoliert werden. Um einen Einblick in die Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheiten, haben wir UC abgeleitet MSCs (UC-MSCs) vom Säugling geliefert in verschiedenen gestational Alter verwendet. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-MSCs aus Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.
Introduction
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind ursprünglich isoliert und charakterisiert aus dem Knochenmark (BM)1,2 aber erhalten Sie auch bei einer Vielzahl von Geweben einschließlich Fettgewebe, Synovialis, Haut, Zahnpulpa und fetalen Anhängsel 3. MSCs sind anerkannt als eine heterogene Zellpopulation, die sich vermehren und in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten differenzieren kann. Darüber hinaus MSCs besitzen die Fähigkeit, migrieren auf Seiten der Verletzung, zu unterdrücken und zu modulieren, Immunantworten, umgestalten und Verletzungen zu reparieren. MSCs aus verschiedenen Quellen haben derzeit wachsendes Interesse als Quelle für die Zelltherapie gegen eine Reihe von hartnäckigen Krankheiten, einschließlich Graft – Versus – Host-Seuche, Myokardinfarkt und Hirninfarkt4,5 angezogen .
Obwohl BM die meisten gut-gekennzeichneten Quelle der MSCs ist, schränkt die Invasivität der BM Aspiration ethisch seiner Zugänglichkeit. Proliferation und Differenzierung Kapazität von MSCs von BM erhalten in der Regel nimmt mit dem Alter des Spenders. Im Gegensatz dazu fetalen MSCs aus fetalen Anhängseln wie Plazenta und Nabelschnurblut (UCB), und Nabelschnur (UC) haben Vorteile, einschließlich weniger ethische Bedenken hinsichtlich Probenahme und robuste Proliferation und Differenzierung Kapazität6 , 7. unter fetalen Anhängsel, die in der Regel als medizinischer Abfall entsorgt werden, UCB und UC sind als eine fetale Orgel, während Plazenta Fetomaternal gilt. Darüber hinaus müssen Plazenta und UCB abgetastet und auf den genauen Zeitpunkt der Neugeborenen Lieferung erhoben, während Plazenta und UC gesammelt und nach der Neugeborenen Lieferung verarbeitet werden kann. UC ist eine vielversprechende MSC-Quelle für Zelle Therapie8,9.
Menschlichen UC mit fortschreitenden Ausbau der Fruchtblase Hohlraum 4-8 Wochen der Schwangerschaft zu entwickeln beginnt, wächst weiter bis 50-60 cm in der Länge und kann während der gesamten Laufzeit des Neugeborenen Lieferung10isoliert werden. Um einen Einblick in die Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheiten, verwenden wir UC abgeleitet MSCs (UC-MSCs) vom Säugling bei verschiedenen gestational Alter11,12geliefert. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zu isolieren und zu charakterisieren UC-MSCs aus Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs können aus einer Vielzahl von Geweben isoliert und sind heterogene Bevölkerung der Zellen, die nicht alle Express derselben phänotypischer Marker tun. Wir beschrieben hier, eine Protokoll, die leitet die Sammlung und sezieren von UC von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen und Isolation und Kultur der UC-MSCs ermöglicht. Nach diesem Protokoll haben wir erfolgreich UC-MSCs isoliert, die erfüllen die ISCT Kriterien19 von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft geliefert un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für Scientific Research (C) (Gewährungsnummer: 25461644) und junge Wissenschaftler (B) (Nummern zu gewähren: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) von JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
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