Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme
Summary
Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.
Abstract
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel thérapeutique considérable et susciter un intérêt croissant dans le domaine biomédical. MSCs sont initialement isolés et caractérisés de la moelle osseuse (BM), puis acquis de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices fœtales comme le placenta, cordon ombilical (UCB) et du cordon ombilical (UC). MSCs sont une population hétérogène de cellules ayant la capacité (1) l’adhérence sur plastique dans des conditions de culture standard, expression du marqueur (2) surface de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Phénotypes /HLA-DR– –et (3) trilineage différenciation en adipocytes et ostéocytes chondrocytes, tel qu’il est définis par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT). Bien que BM est la source plus largement utilisée de MSCs, le caractère invasif d’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs fœtales obtenues UC possèdent des avantages tels que la prolifération vigoureuse et capacité de différenciation. Il n’y a aucun souci éthique pour l’échantillonnage de l’UC, car elle est généralement considérée comme les déchets médicaux. UC humaine commence à se développer avec la croissance de la cavité amniotique à 4-8 semaines d’âge gestationnel continue et continue de croître jusqu’à atteindre 50 à 60 cm de longueur, et il peut être isolé pendant le délai de livraison tout nouveau-né. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous avons utilisé des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.
Introduction
Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement isolés et caractérisé de la moelle osseuse (BM)1,2 mais peut également être obtenues d’une grande variété de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices foetales 3. MSCs sont reconnus comme une population de cellules hétérogènes qui peut proliférer et se différencier en adipocytes et ostéocytes chondrocytes. En outre, MSCs possèdent la capacité de migrer vers des sites de blessures, de réprimer et de moduler les réponses immunitaires et remodeler et de réparer la blessure. Actuellement, MSCs provenant de différentes sources ont suscité un intérêt croissant comme source pour la thérapie cellulaire contre un certain nombre de maladies incurables, dont graft – versus – host disease, infarctus du myocarde et infarctus cérébral4,5 .
Bien que BM est la source plus bien caractérisée de MSCs, l’empiétement que constitue l’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs foetales provenant de foetus appendices comme le placenta, le sang de cordon ombilical (UCB), et du cordon ombilical (UC) ont des avantages, y compris des préoccupations moins éthiques concernant l’échantillonnage et robuste de la prolifération et la différenciation capacité6 , 7. parmi foetales appendices qui sont habituellement mis au rebut comme déchets médicaux, UCB et UC sont considérés comme un organe fœtal, tandis que le placenta est considéré comme des pathologies. En outre, placenta et UCB doivent être échantillonnés et collectées au moment de la livraison de nouveaux-nés, alors que le placenta et l’UC peuvent être collectées et traitées après la livraison de nouveaux-nés. En conséquence, l’UC est une source prometteuse de MSC pour cell therapy8,9.
UC humaine commence à se développer avec l’expansion progressive de la cavité amniotique à 4-8 semaines de gestation, ne cesse de croître jusqu’à 50-60 cm de longueur et peut être isolé pendant toute la durée de livraison nouveau-né10. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous utilisons des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels11,12. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler et caractériser des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs peuvent être isolés dans une variété de tissus et sont une population hétérogène de cellules qui font express pas tous les mêmes marqueurs phénotypiques. Ici, nous avons décrit un protocole qui les guides de la collection et la dissection des UC de nouveau-nés prématurés et à terme et permet l’isolement et la culture de UC-MSCs. Suite à ce protocole, nous avons isolé avec succès UC-MSCs qui remplissent les critères ISCT19 de foetus/les enfants livrés à 19 à 40 semaines …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions pour Scientific Research (C) (numéro de licence : 25461644) et de jeunes scientifiques (B) (accorder des numéros : 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
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