Keuring voor anorganische polyfosfaat in bacteriën
Summary
Beschrijven we een eenvoudige methode voor snelle kwantificering van anorganische polyfosfaat in verschillende bacteriën, waaronder mycobacteriële, gram-negatieve en gram-positieve soorten.
Abstract
Anorganische polyfosfaat (poliep) is een biologische polymeer gevonden in de cellen in alle domeinen van het leven, en is vereist voor de virulentie en stressrespons bij vele bacteriën. Er zijn een aantal manieren om quantifying poliep in biologische materialen, waarvan vele zijn arbeidsintensief of ongevoelig, beperken hun nut. Wij presenteren hier een gestroomlijnde methode voor de kwantificering van de poliep in bacteriën, met behulp van een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters, vertering van poliep met de poliep-specifieke exopolyphosphatase ScPPX, en detectie van de resulterende gratis fosfaat met een gevoelige ascorbinezuur gebaseerde colorimetrische test. Deze procedure is eenvoudig, goedkoop en betrouwbaar poliep kwantificering kan in verschillende bacteriesoorten. Wij presenteren representatieve poliep kwantificering van de gram-negatieve bacterie (Escherichia coli), de gram-positieve melkzuur-bacterie (Lactobacillus reuteri), en mycobacteriële soorten (Mycobacterium smegmatis). We voegen ook een eenvoudig protocol voor nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden van ScPPX, die nog niet commercieel beschikbaar.
Introduction
Anorganische polyfosfaat (poliep) is een lineaire biopolymeer van phosphoanhydride-linked fosfaat eenheden die wordt gevonden in alle domeinen van het leven1,2,3. In diverse bacteriën is poliep essentieel voor de stressrespons, beweeglijkheid, vorming van biofilms, celcyclus controle, antibioticaresistentie en virulentie4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studies van de poliep metabolisme in bacteriën dus het potentieel hebben om opbrengst fundamentele inzichten in het vermogen van bacteriën om te leiden tot ziekte en gedijen in uiteenlopende omgevingen. In veel gevallen zijn de methoden die beschikbaar zijn voor de kwantificering van de poliep in bacteriële cellen echter een beperkende factor in deze studies.
Er zijn verschillende methoden die momenteel gebruikt voor het meten van de poliep in biologische materialen. Deze methoden zijn gewoonlijk twee afzonderlijke stappen: uitpakken van de poliep en kwantificeren van de poliep presenteren in deze extracten. De huidige methode van de goudstandaard, ontwikkeld voor de gist Saccharomyces cerevisiae door Bru en collega’s12, extracten poliep samen met DNA en RNA met behulp van fenol en chloroform, gevolgd door ethanol neerslag, behandeling met deoxyribonuclease (DNase) en ribonuclease (RNase), en de spijsvertering van de resulterende gezuiverde poliep met de S. cerevisiae poliep-vernederende enzym exopolyphosphatase (ScPPX)13 opbrengst gratis fosfaat, dat vervolgens wordt gekwantificeerd met behulp van een Malachiet groen-gebaseerd colorimetrische bepaling. Deze procedure is zeer kwantitatieve maar arbeidsintensief, beperking van het aantal monsters dat kan worden verwerkt in een één experiment, en is niet geoptimaliseerd voor bacteriële monsters. Anderen hebben gemeld poliep extraheren uit een verscheidenheid van cellen en weefsels met behulp van silica kralen (“glassmilk”) of silica membraan kolommen6,14,15,16,17, 18. Deze methoden doen niet efficiënt uitgepakt korte keten poliep (minder dan 60 fosfaat eenheden)12,14,15, hoewel dit van minder belang voor bacteriën, die over het algemeen gedacht zijn te synthetiseren voornamelijk lange-keten poliep3. Oudere methoden van poliep extractie met behulp van sterke zuren19,20 zijn niet langer gebruikte, omdat de poliep is onstabiel onder zure omstandigheden12.
Er zijn ook een aantal gerapporteerde manieren om quantifying poliep. Onder de meest voorkomende is 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), een fluorescente kleurstof meer meestal gebruikt om de vlekken van DNA. DAPI-polyP complexen hebben verschillende fluorescentie excitatie en emissie-maxima dan DAPI-DNA complexen21,22, maar er is aanzienlijke inmenging van andere cellulaire componenten, met inbegrip van RNA, nucleotiden en inositol fosfaten12,15,16,23, vermindering van de specificiteit en de gevoeligheid van de poliep metingen die worden uitgevoerd met behulp van deze methode. U kunt ook poliep en adenosinedifosfaat (ADP) kunnen worden omgezet in adenosine trifosfaat (ATP) met behulp van gezuiverde Escherichia coli poliep kinase (PPK) en de resulterende ATP gekwantificeerd aan de hand van luciferase14,17 ,18. Dit maakt de de ontdekking van zeer kleine hoeveelheden van de poliep, maar vereist twee stappen van de enzymatische reactie en zowel luciferine en zeer zuiver ADP, die dure reagentia. ScPPX specifiek verteert poliep in gratis fosfaat6,12,13,24, die kan worden opgespoord met behulp van de eenvoudiger methoden, maar ScPPX wordt geremd door DNA en RNA12, noodzakelijk DNase en RNase behandelingvan poliep-bevattende extracten. Noch PPK en ScPPX niet commercieel beschikbaar, en PPK zuivering is relatief complexe25,26.
Poliep in cel lysates of uittreksels kan ook worden gevisualiseerd op polyacrylamide gels door DAPI negatieve kleuring27,28,29,30, een methode die beoordeling van ketenlengte wel toegestaan, maar is lage-doorvoer en slecht kwantitatieve.
Nu melden we een snelle, goedkope en middellange-doorvoer poliep assay waarmee snelle kwantificering van de poliep niveaus in verschillende bacteriesoorten. Deze methode begint met het lysing van bacteriële cellen bij 95 ° C in 4 M guanidine isothiocyanaat (GITC)14 om de inactivering van cellulaire fosfatasen genaamd, gevolgd door een silica membraan kolom extractie geoptimaliseerd voor snelle verwerking van meerdere monsters. Het resulterende poliep-bevattende extract wordt dan met een grote overmaat van ScPPX, eliminerend de behoefte aan DNase en RNase behandeling verteerd. We nemen een protocol voor eenvoudige nikkel affiniteit zuivering van mg hoeveelheden ScPPX. Ten slotte is de poliep afkomstige gratis fosfaat gekwantificeerd met een eenvoudige, gevoelige, ascorbinezuur-based colorimetrische bepaling24 en genormaliseerd naar totale cellulaire eiwit. Deze methode stroomlijnt de meting van de poliep in bacteriële cellen, en wij tonen het gebruik ervan met de representatieve soorten van gram-negatieve bacteriën, gram-positieve bacteriën en mycobacteriën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven vereenvoudigt en versnelt de kwantificering van de poliep niveaus in diverse bacteriën, met een typische set 24 monsters nemen ongeveer 1,5 h volledig verwerken. Dit maakt snelle screening van monsters en analyse van de mutant Bibliotheken, en vereenvoudigt de kinetische experimenten voor het meten van de accumulatie van poliep na verloop van tijd. We hebben aangetoond dat het protocol effectief op vertegenwoordigers van drie verschillende stammen werkt: proteobacteria, firmicutes, en Straal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door de Universiteit van Alabama in Birmingham departement microbiologie opstarten middelen en NIH grant R35GM124590 (naar MJG) en NIH subsidie R01AI121364 (FW).
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
