Опробование для неорганических полифосфат бактерий
Summary
Мы опишем простой метод для быстрого количественного определения неорганических полифосфат в различных бактерий, в том числе грамотрицательных и грамположительных микобактериальной видов.
Abstract
Неорганические полифосфаты (полипы) является биологических полимеров, обнаруженные в клетках из всех сферах жизни и требуется для вирулентности и реакции на стресс у многих бактерий. Есть различные методы для количественного определения полип в биологических материалов, многие из которых являются трудоемкими или нечувствительны, ограничивает их полезность. Мы представляем здесь рациональный метод для квантификации полип в бактерии, используя кремнезема мембраны столбца извлечения оптимизирован для быстрой обработки нескольких образцов, пищеварение полипа с exopolyphosphatase полипа конкретных ScPPX и обнаружение в результате бесплатные фосфат с конфиденциальной основе аскорбиновой кислоты колориметрические assay. Эта процедура является простой, недорогой и позволяет надежный полипа количественной оценки различных видов бактерий. Мы представляем представитель полипа количественной грамотрицательных бактерий (Escherichia coli), грамположительных молочнокислые бактерии (Lactobacillus reuteri) и микобактериальной видов (Mycobacterium smegmatis). Мы также включать простой протокол для очищение сродства никеля мг количества ScPPX, который в настоящее время не имеющиеся.
Introduction
Неорганические полифосфаты (полипы) является линейным биополимера единиц связано phosphoanhydride фосфат, встречается во всех сферах жизни1,2,3. В разнообразных бактерий полип имеет важное значение для реакции на стресс, моторику, биопленки, клеточного цикла управления, антибиотикам и вирулентности4,5,6,7,8 ,9,10,11. Исследования метаболизма полип в бактериях таким образом имеют потенциал для урожайности основных понимание способности бактерий вызывают болезни и процветать в различных средах. Во многих случаях однако, методы, доступные для количественного определения полип в бактериальных клетках являются сдерживающим фактором в этих исследованиях.
Существует несколько методов, в настоящее время используется для измерения уровней полип в биологических материалах. Эти методы обычно включают два отдельных этапов: извлечение полипов и количественное определение полипа присутствующие в эти выдержки. Текущий метод золотой стандарт, разработанный для дрожжей Saccharomyces cerevisiae Бру и коллеги12, экстракты полипа наряду с ДНК и РНК с помощью фенола и хлороформа, а затем высыпанием этанола, лечение с дезоксирибонуклеаза (DNase) и рибонуклеазы (РНКазы) и пищеварение результате очищенный полипа с S. cerevisiae унижающего достоинство полипа фермента exopolyphosphatase (ScPPX)13 давать бесплатные фосфат, который затем количественно с помощью Малахит на основе зеленого колориметрические assay. Эта процедура является весьма количественные, но трудоемкий, ограничивая количество выборок, которые могут быть обработаны в одном эксперименте и не оптимизирован для бактериальных образцов. Другие сообщали, извлечение полипов из различных клеток и тканей, с использованием кремния бусины («glassmilk») или кремнезема мембрана колонок6,14,15,16,17, 18. Эти методы не извлечь эффективно короткие цепи полип (менее 60 единиц фосфат)12,14,15, хотя это меньше озабоченности для бактерий, которые обычно считается главным образом синтезировать 3длинноцепочечных полипа. Старые методы добычи полипа, используя сильных кислот19,20 больше не широко используются, так как полип нестабильно при кислых условиях12.
Есть также целый ряд зарегистрированных методы для количественного определения полипа. Среди наиболее распространенных — 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), флуоресцентные краски более обычно используется для пятно ДНК. DAPI-полип комплексы имеют различные флуоресценции возбуждения и выбросов Максима чем DAPI-ДНК комплексы21,22, но есть значительные помехи от других клеточных компонентов, включая РНК, нуклеотиды и инозитол фосфаты12,15,16,23, уменьшение специфичность и чувствительность измерений полипа, сделанные с помощью этого метода. Кроме того, полип и аденозиндифосфат (ADP) могут быть преобразованы в аденозинтрифосфат (АТФ) с использованием очищенного Escherichia coli полипа киназы (ППК) и результирующая АТФ, количественно с помощью Люцифераза14,17 ,18. Это позволяет обнаружить очень небольшое количество полипов, но требует двух шагов ферментативной реакции и люциферин и очень чистый ADP, которые являются дорогостоящих реагентов. ScPPX, специально дайджесты полип в свободной фосфат6,12,13,24, которые могут быть обнаружены с помощью более простые методы, но ScPPX тормозится12ДНК и РНК требующих DNase и РНКазы лечение полипа содержащих экстракты. ППК ни ScPPX коммерчески доступны, и очистки ППК является относительно сложным25,26.
Полип в lysates клетки или выписки также могут быть визуализированы на гелях полиакриламида, DAPI негативные пятнать27,28,29,30, метод, который позволяет оценить длину цепочки, но низкая пропускная способность и плохо количественные.
Мы теперь сообщают assay быстрый, недорогой, средне пропускной полип, который позволяет быстро квантификации полипа уровней в различных видов бактерий. Этот метод начинает с лизировать клетки бактерий при 95 ° C в 4 М гуанидина Изотиоцианаты (GITC)14 для инактивации сотовой фосфатаз, следуют кремнезема мембраны столбца извлечения оптимизирован для быстрой обработки нескольких образцов. Затем полученный полип содержащих экстракт переваривается с большим избытком ScPPX, устраняя необходимость DNase и РНКазы лечения. Мы включать протокол для простой очищение сродства никеля мг количества ScPPX. Наконец полип производные бесплатно фосфат количественно с простой, чувствительных, аскорбиновая кислота основе колориметрические пробирного24 и нормализуется до общего клеточного белка. Этот метод упрощает измерения полип в бактериальных клетках, и мы продемонстрировать его использование с представителем видов грамотрицательных бактерий, грам-положительных бактерий и микобактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь упрощает и ускоряет количественного определения уровней полип в разнообразных бактерий, с типичным набором 24 пробы, принимая около 1,5 ч для полной обработки. Это позволяет быстрого отбора проб и анализа мутант библиотек и упрощает кинетическая эксперименты, и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан Университет штата Алабама в Бирмингеме Кафедра микробиологии запуска средства и NIH Грант R35GM124590 (MJG) и низ Грант R01AI121364 (FW).
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
