JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Testmetoder för oorganiska polyfosfat i bakterier

Published: January 21, 2019
doi:
10.3791/58818
, , ,
1Department of Microbiology,University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases,University of Alabama at Birmingham

Summary

Vi beskriver en enkel metod för snabb kvantifiering av oorganiska polyfosfat i olika bakterier, inklusive gramnegativa, grampositiva och mykobakteriella arter.

Abstract

Oorganiska polyfosfat (polyP) är en biologisk polymer som finns i celler från alla domäner i livet, och krävs för virulens och stressreaktion hos många bakterier. Det finns en mängd metoder för att kvantifiera polyP i biologiska material, av vilka många är antingen arbetsintensiva eller okänsliga, begränsar deras användbarhet. Vi presenterar här en strömlinjeformad metod för polyP kvantifiering i bakterier, använder en kvarts membran kolumn utvinning optimerad för snabb behandling av flera prover, rötning av polyP med den polyP-specifika exopolyphosphatase ScPPX, och upptäckt av den resulterande gratis fosfat med en känslig ascorbic syra-baserade kolorimetriska analys. Proceduren är enkel, billig och ger tillförlitlig polyP kvantifiering i olika bakteriearter. Vi presenterar representativa polyP kvantifiering från gramnegativa bakterien (Escherichia coli), den grampositiva mjölksyrabakterier (Lactobacillus reuteri) och mykobakteriella arten (Mycobacterium smegmatis). Vi har även ett enkelt protokoll för nickel affinitet rening av mg mängder av ScPPX, som för närvarande inte är kommersiellt tillgängliga.

Introduction

Oorganiska polyfosfat (polyP) är en linjär biopolymer av phosphoanhydride-länkade fosfat enheter som finns i alla domäner i livet1,2,3. I olika bakterier är polyP avgörande för stressreaktion, motilitet, biofilm bildning, cellcykeln kontroll, antibiotikaresistens och virulens4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studier av polyP metabolism i bakterier har därför potential att ge grundläggande insikter i förmågan hos bakterier kan orsaka sjukdom och trivs i olika miljöer. I många fall är metoderna för kvantifiera polyP i bakterieceller dock en begränsande faktor i dessa studier.

I området i närheten finns det flera metoder som används för att mäta polyP i biologiskt material. Dessa metoder omfattar vanligtvis två distinkta steg: extrahera polyP och kvantifiera polyP närvarande i dessa extrakt. Den nuvarande guldmyntfoten metod, utvecklat för jästen Saccharomyces cerevisiae av Bru och kollegor12, extrakt polyP tillsammans med DNA och RNA med hjälp av fenol och kloroform, följt av etanol nederbörd, behandling med deoxyribonuclease (DNase) och ribonunkleas (RNase) och nedbrytning av den resulterande rena polyP med S. cerevisiae polyP-nedbrytande enzymet exopolyphosphatase (ScPPX)13 att ge gratis fosfat, som då kvantifieras med hjälp av en malakit green-baserade kolorimetriska analys. Detta förfarande är mycket kvantitativa men arbetsintensiva, begränsa antalet prover som kan bearbetas i en enda experiment, och är inte optimerad för bakteriell prover. Andra har rapporterat utvinna polyP från en mängd olika celler och vävnader med hjälp av kiseldioxid pärlor (”glassmilk”) eller kiseldioxid membran kolumner6,14,15,16,17, 18. Dessa metoder inte effektivt extrahera kort kedja polyP (mindre än 60 fosfat enheter)12,14,15, även om detta är av mindre intresse för bakterier, som allmänt anses syntetisera primärt långkedjiga polyP3. Äldre metoder av polyP extraktion med starka syror19,20 används inte längre, eftersom polyP är instabil under sura förhållanden12.

Det finns också en mängd rapporterade metoder för att kvantifiera polyP. Bland de vanligaste är 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), ett fluorescerande färgämne mer vanligtvis används för att färga DNA. DAPI-polyP komplex har olika fluorescens excitation och utsläpp maxima än DAPI-DNA komplex21,22, men det finns avsevärda störningar från andra cellulära komponenter, inklusive RNA, nukleotider och inositol fosfater12,15,16,23, minska specificitet och känslighet av polyP mätningar som görs med denna metod. Alternativt, polyP och adenosindifosfat (ADP) kan omvandlas till adenosintrifosfat (ATP) med hjälp av renat Escherichia coli polyP kinase (PPK) och den resulterande ATP kvantifieras med hjälp av luciferas14,17 ,18. Detta tillåter att upptäcka mycket små mängder av polyP, men kräver två enzymatisk reaktion steg och både luciferin och mycket ren ADP, som är dyra reagenser. ScPPX specifikt smälter polyP in gratis fosfat6,12,13,24, som kan upptäckas med hjälp av enklare metoder, men ScPPX hämmas av DNA och RNA12, vilket kräver DNAS och RNase behandling av polyP-innehållande extrakt. Varken PPK eller ScPPX är kommersiellt tillgängliga, och PPK rening är relativt komplex25,26.

PolyP i cell lysates eller extrakt kan också visualiseras på polyakrylamidgeler av DAPI negativ färgning27,28,29,30, en metod som tillåter bedömning av Kedjanslängd, men är låg genomströmning och dåligt kvantitativa.

Vi rapporterar nu en snabb, billig, medium-genomströmning polyP analysmetod som tillåter snabb kvantifiering av polyP nivåer i olika bakteriearter. Denna metod börjar av lyseringslösning bakterieceller vid 95 ° C i 4 M guanidin fluoresceinisothiocyanat (GITC)14 om du vill inaktivera cellulära fosfataser, följt av en kvarts membran kolumn utvinning optimerad för snabb behandling av flera prover. Det resulterande polyP-innehållande extraktet är sedan smälta med ett stort överskott av ScPPX, vilket eliminerar behovet av DNAS och RNase behandling. Vi inkluderar ett protokoll för okomplicerad nickel affinitet rening av mg mängder ScPPX. Slutligen är polyP-derived gratis fosfat kvantifieras med en enkel, känslig, askorbinsyra-baserade kolorimetriska analys24 och normaliserade till cellulära totalprotein. Denna metod effektiviserar mätning av polyP i bakterieceller, och vi visar dess användning med företrädare arter i gramnegativa bakterier, grampositiva bakterier och mykobakterier.

Protocol

1. renande jäst Exopolyphosphatase (ScPPX) Omvandla E. coli protein överuttryck stammen BL21(DE3)31 med plasmiden pScPPX26 av elektroporation32 eller kemisk omvandling33. Inokulera 1 L lysogeny buljong (LB) innehållande 100 µg mL-1 ampicillin i en 2 L unbaffled kolv med en enda koloni av BL21(DE3) som innehåller pScPPX2 och inkubera över natten vid 37 ° C utan skakningar, till en …

Representative Results

De viktigaste stegen i protokollet är kartlagt i förenklad form i figur 1. För att demonstrera användningen av detta protokoll med gramnegativa bakterier, vildtyp E. coli MG165539 vuxit till mitten av log fas i LB rikt medium vid 37 ° C under skakning (200 rpm), sedan sköljas och inkuberas i en ytterligare 2 h i morpholinopropanesulfonate-buffrade (moppar) mini…

Discussion

Protokollet beskrivs här förenklar och påskyndar kvantifiering av polyP nivåer i olika bakterier, med en typisk uppsättning 24 prov tar ca 1,5 h fullt bearbeta. Detta möjliggör snabb screening av prover och analys av muterade bibliotek och förenklar kinetiska experiment mäter ansamling av polyP över tid. Vi har visat att protokollet fungerar effektivt på företrädarna för tre olika phyla: proteobacteria, firmicutes, och actinobacteria, som är ökända för sin motståndskraftig, svårt att lysera cellvägga…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Projektet stöddes av University of Alabama i Birmingham Institutionen för mikrobiologi start medel och NIH grant R35GM124590 (att MJG) och NIH bidrag R01AI121364 (FW).

Materials

E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
  33. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

Inorganic PolyphosphateBacterial Stress ResponsePolyP ExtractionPolyP QuantificationLactobacillus ReuteriGITC Lysis BufferBradford AssayEthanol PrecipitationSilica MembraneTris-HCl BufferPhosphate Standards
check_url/58818?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image