Assaying for uorganiske Polyphosphate i bakterier
Summary
Vi beskriver en enkel metode for rask kvantifisering av uorganiske polyphosphate i forskjellige bakterier, inkludert Gram-negative Gram-positive og mycobacterial art.
Abstract
Uorganiske polyphosphate (polypp) er en biologisk polymer i celler fra alle livsområder og kreves for virulens og stressrespons i mange bakterier. Det finnes en rekke metoder for å kvantifisere polypp i biologisk materiale, hvorav mange er arbeidskrevende eller ufølsomme, begrenser deres nytten. Vi presenterer her en strømlinjeformet metode for polypp kvantifisering i bakterier, bruker en silica membran kolonnen utvinning optimalisert for rask behandling av flere eksempler, fordøyelsen av polypp med polypp-spesifikke exopolyphosphatase ScPPX og oppdagelsen av den resulterende gratis fosfat med en følsom askorbinsyre-baserte kolorimetrisk analysen. Denne fremgangsmåten er enkel, billig, og gir pålitelig polypp kvantifisering i ulike bakterie-art. Vi presenterer representant polypp kvantifisering Gram-negative bakterien (Escherichia coli), Gram-positive melkesyre bakterien (Lactobacillus reuteri) og den mycobacterial arten (Mycobacterium smegmatis). Vi har også en enkel protokoll for nikkel affinitet rensing av mg mengder ScPPX, som er ikke kommersielt tilgjengelig.
Introduction
Uorganiske polyphosphate (polypp) er en lineær Research phosphoanhydride knyttet fosfat enheter som finnes i alle domener livet1,2,3. I ulike bakterier er polypp avgjørende for stressrespons, motilitet, biofilm formasjon, celle målesyklus, antibiotikaresistens og virulens4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studier av polypp metabolismen i bakterier derfor har potensial til å gi grunnleggende innsikt i evnen av bakterier forårsaker sykdommen og trives i ulike miljøer. I mange tilfeller er imidlertid metodene tilgjengelig for kvantifisere polypp i bakterieceller en begrensende faktor i disse studiene.
Det finnes flere metoder som brukes til å måle polypp nivåer i biologisk materiale. Disse metodene omfatter vanligvis to forskjellige trinn: utpakking polypp og kvantifisere polyP stede i disse ekstrakter. Den gjeldende gull standard metode, utviklet for gjær Saccharomyces cerevisiae med Bru og kolleger12ekstrakter polypp DNA og RNA med fenol og kloroform, etterfulgt av etanol nedbør, behandling med deoxyribonuclease (DNase) og ribonuclease (RNase), og fordøyelsen av resulterende renset polyP med S. cerevisiae polypp-nedverdigende enzymet exopolyphosphatase (ScPPX)13 å gi gratis fosfat, som er deretter kvantifisert ved hjelp av en malakitt grønn-baserte kolorimetrisk analysen. Denne fremgangsmåten er svært kvantitative men arbeidskrevende, begrense antall eksempler som kan behandles i ett enkelt eksperiment, og er ikke optimalisert for bakteriell prøver. Andre har rapportert utpakking polypp fra en rekke celler og vev silica perler (“glassmilk”) eller silica membran kolonner6,14,15,16,17, 18. Disse metodene ikke effektivt pakke ut korte kjeden polypp (mindre enn 60 fosfat enheter)12,14,15, men dette er mindre bekymring for bakterier, som er vanligvis antatt å syntetisere primært langkjedede polypp3. Eldre metoder polypp ekstraksjon med sterke syrer19,20 er ikke lenger utbredt, siden polypp er ustabile under Sure forhold12.
Det er også en rekke rapporterte metoder for å kvantifisere polypp. Blant de vanligste er 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), en fluorescerende farge flere vanligvis brukes stain DNA. DAPI-polypp komplekser har forskjellige fluorescens eksitasjon og utslipp maxima enn DAPI-DNA komplekser21,22, men det er betydelige forstyrrelser fra andre cellulære komponenter, inkludert RNA, nukleotider og inositol fosfater12,15,16,23, redusere spesifisitet og følsomhet av polypp målinger med denne metoden. Alternativt polypp og adenosindifosfat (ADP) kan konverteres til adenosin trifosfat (ATP) bruker renset Escherichia coli polypp kinase (PPK) og resulterende ATP kvantifisert bruk luciferase14,17 ,18. Dette gjør påvisning av svært små mengder polypp, men krever to enzymatiske reaksjonen trinn og både luciferin og svært ren ADP, som er dyre reagenser. ScPPX spesielt fordøyer polypp i gratis fosfat6,12,13,24, som kan oppdages ved hjelp av enklere metoder, men ScPPX er hemmet av DNA og RNA12, nødvendiggjør DNase og RNase behandling av polypp inneholder ekstrakter. PPK verken ScPPX er kommersielt tilgjengelige PPK rensing er relativt komplisert25,26.
Polypp i celle lysates eller ekstrakter kan også visualiseres på polyakrylamid gels DAPI negative flekker27,28,29,30, en metode som tillater vurdering av chain lengden, men er lav gjennomstrømming og dårlig kvantitative.
Vi nå rapporterer om en rask, billig, medium gjennomstrømming polypp analysen som tillater rask kvantifisering av polypp nivåer i ulike bakterie-art. Denne metoden starter ved lysing bakterieceller 95 ° c i 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 for å deaktivere mobilnettet phosphatases, etterfulgt av en silica membran kolonnen utvinning optimalisert for rask behandling av flere eksempler. Den resulterende polypp inneholder ekstrakt er deretter fordøyd med en stor overskudd av ScPPX, eliminerer behovet for DNase og RNase. Vi inkluderer en protokoll for enkel nikkel affinitet rensing av mg mengder ScPPX. Endelig er polypp-avledet gratis fosfat kvantifisert med en enkel, følsom, askorbinsyre-baserte kolorimetrisk analysen24 og normalisert totale mobilnettet protein. Denne metoden strømlinjeformer måling av polypp i bakterielle celler, og vi viser bruken med representant arter av Gram-negative bakterier, Gram-positive bakteriene og mykobakterier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her forenkler og akselererer kvantifisering av polypp i forskjellige bakterier, med et vanlig sett med 24 prøver tar ca 1,5 t fullt behandle. Dette tillater rask screening av prøver og analyse av mutant biblioteker og forenkler kinetic eksperimenter måle akkumulering av polypp over tid. Vi har vist at protokollen fungerer effektivt på representanter for tre ulike rekker: proteobacteria, firmicutes, og actinobacteria, som er beryktet for sin elastiske, vanskelig å lyse cellevegger<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av University of Alabama i Birmingham instituttet for mikrobiologi oppstart midler og NIH grant R35GM124590 (å MJG) og NIH grant R01AI121364 (til FW).
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
