التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية
Summary
نقدم هنا، هو بروتوكول وصف زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة ويسمح المتكررة التقييمات ميني المنظار في القولون القاصي في الموقع للوجود والخصائص، وشدة التهاب colonic داخل الحي الفئران التي تعاني من الابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض.
Abstract
الاختلاس – مقابل – المضيف الأمراض الحادة (GvHD) تمثل مضاعفات أشد أن المرضى الذين يتلقون سابقا متمكنة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (الو-HCT) زرع الوجه، وكثيراً ما يرتبط مع التوصل إلى نتائج سريرية فقراء. بعض الوقت، على سبيل المثال، عادة ما تستجيب للعلاجات المناعية القمعية أنشئت GvHD مظاهر الجلد و، ومن ثم عدم اتخاذ مسار فادح، والوجود وكثافة جفهد المعوية، خصوصا من منتصف إلى انخفاض أجزاء من القناة الهضمية، تؤثر بقوة على النتائج وعموما البقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يعانون من الخيارات الحادة GvHD. العلاجية تقتصر أساسا على وكلاء المناعي القمعية الكلاسيكية الغلة معتدلة فقط آثار التخفيف من حدة المرض. ومن ثم معرفة مفصلة حول تتالي المقيم في الأنسجة المناعية، والتغيرات في الحجمية المعوية، والاستجابة stromal السابقة، عليها، وبعد ظهور جفهد المعوية هناك حاجة ماسة لفهم الأحداث والآليات التي تقوم عليها، المرضية ووضع الخيارات العلاجية المبتكرة. نماذج مورين من GvHD غالباً ما يلجأ إلى تحديد وتقييم وظيفيا الجزيئات ومسارات قيادة مزعومة GvHD المعوية. ومع ذلك، يعني على وجه الخصوص رصد وتقييم التهاب الأمعاء على مر الزمن تنعدم أساسا منذ عشرات المتبعة لتقييم والصف GvHD الحادة بشكل روتيني تتألف من مختلف المعايير التي تعكس GvHD النظامية بدلاً من ذلك مظاهرة. التقييم التفصيلي ل GvHD المعوية قد قيدت للدراسات باستخدام الفئران euthanized، وبالتالي أساسا باستثناء طولية (أي الحركية) تحليلات لحجرة colonic تحت شرط تجريبي معين (مثلاً، جسم بوساطة الحصار الذي تفرضه سيتوكين proinflammatory) في الفئران حية (أي، في فيفو). التقييم في الموقع ميني المنظار القولون القاصي الو-كليات التقنية العليا-يعامل الفئران الموصوفة هنا يسمح أ) تقييما مفصلاً عيانية لجوانب مختلفة من التهاب الأمعاء وب) الخيار لجمع عينات الأنسجة لتحليلات المصب في نقاط زمنية مختلفة على مدى فترة الملاحظة. إجمالاً، يوفر نهج ميني المنظار تقدما كبيرا في رصد موسع السريري وتقييم جفهد المعوية.
Introduction
المكونة للدم الأورام الخبيثة الناشئة مباشرة عن حجرة الخلايا الجذعية المكونة للدم وغير المنضبط، تتقدم بسرعة، واضطرابات جهاز المناعة بوساطة شديدة غالباً مؤشرات أداء كليات الو1،2. ولكن على الرغم من أن المحاسبة لحدوث استجابة الابتزاز مقابل الورم تشخيصية مفيدة، لمفاوية المانحين كثيرا ما حفز وتعزيز هجوم المناعي بوساطة غير المرغوب فيها من مكونات الأنسجة السليمة داخل المتلقي الو-كليات ، عملية التي تسمى الاختلاس – مقابل – المضيف المرض3. مظاهرة في القناة الهضمية، جفهد المعوية ما يسمى، تمثل المضاعفات الأكثر اللعين من الحادة GvHD، الأشكال الخطيرة التي ترتبط بصورة روتينية مع ارتفاع معدل وفيات1،،من24.
عموما، موريني ونماذج لالو-HCT ظهرت كأدوات لا تقدر بثمن لتحديد ودراسة الآليات المناعية بوساطة الكامنة وراء أمراض ال جفهد5. بيد الحركية من، على سبيل المثال، الآثار المفيدة للتدخلات العلاجية رواية على مر الزمن في الفئران الحية بشكل روتيني يعتمد التقييم على تحديد GvHD السريرية عشرات6. بينما هذه النقاط مناسبة لكي تعكس، على سبيل المثال، عموما عبء المرض (أي، GvHD النظامية)، السريرية عشرات عدم حساسية موثوق بها تعكس المظاهر الخاصة بالجهاز (مثل، في القناة الهضمية). ومن ثم، الاستنتاجات، على سبيل المثال فيما يتعلق بآثار واقية من القناة الهضمية لتدخل علاجي معين، التي تستند إلى هذه التهديف النظم عادة ما تقع قصيرة.
وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير من خلال اختراع رواية كامل الجسم التصوير طرائق في تركيبة مع الاستخدام أما الماوس الوراثية طرحه أو الفلورسنت نماذج7،8، منهجيات لمباشرة، وعلى وجه التحديد تقييم الأمعاء تنعدم مظاهر جفهد في الفئران الحية. ومن ثم فالأساس المنطقي وراء بروتوكول التقييم بالمنظار للنمط الظاهري GvHD المعوية الموصوفة في المقطع التالي للتغلب على هذه العقبة. وعلاوة على ذلك، أن الدافع أيضا خفض إعداد الفئران التجريبية منذ ذلك الحين، وحتى الآن، إجراء تقييم مفصل للخصائص الخلوية والجزيئية المورفولوجية (مثل، بالتشريح المرضى أو البيولوجيا الجزيئية) من GvHD المعوية في نهاية المطاف استلزم مظاهر التضحية بالماوس التجريبية.
قد سبق أن أبلغ مؤسستنا على منهجية التقييم بالمنظار ميني لمظاهر colonic أثناء التهاب القولون سينجينيك نماذج9. في البروتوكول المعروضة هنا، لدينا المكرر وتكييفها كولونوسكوبيك التهديف مصفوفة ليحركها اللوريسبونسي التهاب القولون في الفئران حية مع GvHD المعوية عند زرع اللوريكتيفي لمفاوية كليات التقنية العليا والجهات المانحة في فئة MHC تماما متطابقة الإعداد . وقد حددنا أربعة المعلمات المناسبة تعكس آفات colonic المعوية المتصلة GvHD. وعلاوة على ذلك، أنشأنا نظاما يتيح درجات صقل لأي واحد محدد، أسفر عن نقاط جديدة بسهولة إطلاع القارئ شدة GvHD المعوية الموجودة في ماوس معينة في نقطة زمنية معينة. وأكدت تحاليل نسيجية أن درجة المنظار عتبة معينة هو موثوق التنبؤ بدرجة معتدلة إلى عالية التهاب الأنسجة. ومن ثم، يظهر التقييم بالمنظار ميني لتمثيل بديل عامل للأنسجة معيار الذهب الذي يتطلب التضحية بالفئران التجريبية بشكل روتيني. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها في أي نقطة زمنية معينة، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا خلال ال10،المرض11. وعلاوة على ذلك، على النقيض من استخدام نهج تعتمد على الإضاءة الحيوية، أية تدابير العمل المكثف وتستغرق وقتاً طويلاً مثل إينتيركروسينج وراثيا تعديل الفئران مطلوبة و، ومن ثم يمكن تطبيق المنهجية على أي خط الماوس الفائدة.
أخذت معا، نظراً لمنظور السريرية تضر مرضى الو-HCT GvHD المعوية الحادة، التقدم العلمي السريع ومزيد من التبصر في الآليات الجزيئية الكامنة وراء أمراض المناعة هناك حاجة ماسة. وبالمثل، تتطلب الاعتبارات الأخلاقية الهامة، وأن كسب المعرفة ينبغي أن يتحقق مع استخدام أقل عدد ممكن من الفئران التجريبية. ومن ثم على حد سواء الاعتراف بالمطالبات في أوساط البحث استكشاف GvHD المعوية يمكن أن يخدمها تنفيذ المسلسل التقييمات ميني المنظار في القولون في سلسلة العمل التجريبي لرصد والصف GvHD المعوية في الماوس التجريبية الحية النماذج، كوصف والمصادق عليها في البروتوكول المعروضة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف البروتوكول منهجية الاستقراء والتقييم ميني المنظار من النمط الظاهري colonic لاحظ أثناء جفهد المعوية. أنه يخدم الغرض الأوسع نطاقا لتمكين العلماء لدراسة جفهد المعوية طوليا ونونينفاسيفيلي على مدى كامل من المرض (أي من بداية مظاهر colonic والتقدم حتى نشاط المرض القصوى).
ومع ذلك، هن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دعمت هذه الدراسة التعاونية أبحاث المراكز (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG، #324392634؛ المشروع B03) (إلى ك. أ.) و 1181 لجنة حقوق الطفل (CRC-DFG، مشروع B05) (إلى ك. أ.)، وكلاهما يمولها الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية).
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
