Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença– host.
Abstract
Aguda enxerto doença contra o hospedeiro (GvHD) representa a complicação mais grave que pacientes submetidos anteriormente a cara (allo-HCT) de transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e frequentemente está associada com um resultado clínico ruim. Quando, por exemplo, GvHD manifestações da pele são geralmente responsivos às terapias imune-supressora estabelecidas e, portanto, não vai levar um curso fatal, a presença e a intensidade da GvHD intestinal, especialmente das partes meados-de-inferior do intestino, influenciar fortemente o resultado e geral sobrevida de pacientes com aguda DECH. opções terapêuticas são essencialmente limitados aos agentes imune-supressora clássicos rendendo apenas moderados efeitos atenuantes a doença. Portanto, conhecimento detalhado sobre a cascata imune do tecido-residente, alterações na microbiota intestinal, e a resposta do estroma anterior, em cima e depois do aparecimento de GvHD intestinal são urgentemente necessários para compreender os eventos e os mecanismos subjacentes a patogênese e desenvolver opções terapêuticas inovadoras. Modelos murino de GvHD são frequentemente empregados para identificar e avaliar funcionalmente moléculas e vias de condução presumidamente GvHD intestinal. No entanto, meios especificamente monitorar e avaliar a inflamação intestinal ao longo do tempo são essencialmente falta desde que escores estabelecidos para avaliar e corrigir GvHD aguda rotineiramente são compostos de vários parâmetros que melhor reflectem GvHD sistêmica manifestações. A avaliação detalhada da GvHD intestinal foi restringida aos estudos usando ratos sacrificados, excluindo, assim, essencialmente longitudinal (i.e., cinética) análises do compartimento do cólon sob uma determinada condição experimental (por exemplo, anticorpo mediada bloqueio de uma citocina proinflammatory) em camundongos ao vivo (i.e., na vivo). A avaliação in situ miniendoscópica do cólon distal dos ratos allo-HCT-tratada aqui descrito permite um) uma detalhada avaliação macroscópica dos diferentes aspectos da inflamação intestinal e b) a opção para coletar amostras de tecido para análises a jusante no vários pontos de tempo ao longo do período de observação. Em geral, a abordagem endoscópica-mini fornece um grande avanço na monitorização não invasiva pré-clínica e avaliação de GvHD intestinal.
Introduction
Malignidades hematopoiéticas directamente decorrentes do compartimento de células-tronco hematopoiéticas e descontrolada, progredindo rapidamente e distúrbios graves de imune-mediada são frequentemente indicações para executar allo-HCT1,2. No entanto, apesar de contabilidade para a ocorrência da resposta enxerto-versus-tumor prognóstica benéfica, linfócitos do doador são frequentemente induzindo e promovendo um ataque imune-mediada indesejado de componentes de tecido saudável dentro do destinatário allo-HCT , um processo que é chamado de doença do enxerto – versus – hospedeiro3. Manifestações no intestino, o so-called GvHD intestinal, representam a mais temida complicação da DECH aguda, formas graves de que são rotineiramente associadas com uma elevada taxa de mortalidade1,2,4.
Modelos globais, murino de allo-HCT têm emergido como inestimáveis ferramentas para identificar e estudar mecanismos imune-mediada subjacentes a patogênese da GvHD5. No entanto, avaliação cinética de, por exemplo, efeitos benéficos do romance intervenções terapêuticas ao longo do tempo em ratos vivos rotineiramente baseia a determinação da GvHD clínico pontuações6. Enquanto essas pontuações são adequadas para refletir, por exemplo, a carga doença global (ou seja, a DECH sistêmica), clínica marca falta a sensibilidade para espelhar confiantemente manifestações específicas do órgão (por exemplo,, no intestino). Portanto, as conclusões, por exemplo no que diz respeito a efeitos de intestino-protetor de uma determinada intervenção terapêutica, que se baseiam estes sistemas de pontuação, geralmente deixam a desejar.
Apesar dos grandes avanços através da invenção de novela todo o corpo de imagem modalidades em combinação com o uso de qualquer rato genética bioluminescentes ou fluorescente modelos7,8, metodologias para diretamente e especificamente avaliar o intestinal manifestação da DECH em ratos vivos estão faltando. Portanto, a lógica por trás do protocolo da avaliação endoscópica do fenótipo intestinal GvHD descrito na próxima seção é para ultrapassar este obstáculo. Além disso, a motivação também é reduzir o número de ratos experimentais desde que, até agora, uma avaliação detalhada das características morfológicas, celulares e moleculares (por exemplo,, por histopatologia ou biologia molecular) de GvHD intestinal manifestação em última análise, é exigido o sacrifício do mouse experimental.
Nossa instituição tem relatado anteriormente na metodologia de uma miniendoscópica avaliação das manifestações do cólon, no curso de modelos de colite syngeneic9. No protocolo apresentado aqui, nós temos refinado e adaptado a polictomia matriz de Pontuação para colite alloresponse-conduzido em camundongos ao vivo com GvHD intestinal após transplante de alloreactive linfócitos HCT e doador em uma classe de MHC eu totalmente incompatíveis configuração . Identificamos quatro parâmetros adequados para refletir intestinais lesões do cólon DECH-relacionados. Além disso, nós estabelecemos um sistema que permite uma classificação aperfeiçoá-lo de qualquer determinante único, resultando em uma nova partitura que prontamente informa o leitor sobre a gravidade da GvHD intestinal presente em um determinado do mouse em um ponto determinado do tempo. Análises histopatológicas confirmaram que um escore endoscópico acima de um determinado limiar confiantemente está prevendo a inflamação do tecido de grau moderado a alto. Portanto, avaliação endoscópica-mini parece representar um substituto do trabalho para a Histopatologia do padrão-ouro que rotineiramente exige o sacrifício dos ratos experimentais. Importante, este protocolo pode ser aplicado em praticamente qualquer ponto de tempo determinado e pode ser usado várias vezes durante o curso da doença10,11. Além disso, em contraste com o uso de abordagens de bioluminescência-dependente, não do trabalho intenso e demoradas como intercrossing geneticamente modificados ratos são necessárias medidas e, portanto, a metodologia pode ser aplicada em praticamente qualquer linha de rato de interesse.
Tomados em conjunto, do ponto de vista clínico prejudicial de allo-HCT os pacientes com DECH intestinal grave, rápidos progressos científicos e mais insight sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese imunológica são urgentemente necessários. Da mesma forma, considerações importantes, éticas exigem que o ganho de conhecimento deve ser alcançado com o uso do número mínimo de ratos experimentais. Portanto, ambos reconhecidos créditos sobre a comunidade de pesquisa explorando GvHD intestinal podem ser avançados implementando seriais avaliações miniendoscópica do cólon na cadeia de trabalho experimental para monitorar e grau GvHD intestinal no rato experimental ao vivo modelos, como descrito e validados no protocolo aqui apresentado.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descreve a metodologia de indução e miniendoscópica avaliação do fenótipo do cólon observada no decurso de GvHD intestinal. Serve o propósito maior de permitir aos cientistas estudar GvHD intestinal longitudinalmente e de forma não invasiva, ao longo de toda doença (ou seja, desde o início da manifestação do cólon e progressão até a atividade da doença máxima).
No entanto, existem alguns passos críticos e importantes limitações inerentes aos métodos de apresen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo Collaborative Research centros CRC () 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; projeto B03) (para KH) e CRC 1181 (CRC-DFG, projeto B05) (para KH), ambos financiados pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, alemão Research Foundation).
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
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